生物化学：第三章 蛋白质(5周1节) .pdf

上节内容回顾  蛋白质的结构与功能 几种蛋白质的结构与功能 收缩与能动蛋白、免疫球蛋白  蛋白质的性质 两性离子、胶体、沉淀、变性与复性、折叠、紫外吸收  蛋白质的分离纯化与鉴定 盐析、离子交换、等电聚焦、凝胶过滤、SDS 本章主要内容 一．蛋白质概述 二．氨基酸 (重点) 三．多肽（重点） 四．蛋白质的结构（重点） 五．蛋白质结构与功能（重点） 六．蛋白质的性质（重点） 七．蛋白质的分离纯化与鉴定（重点） 七、Protein Purification 1. Salting out 2. Ion exchange chromatography 3. Isoelectric focusing 4. Gel filtration chromatography 5. SDS 6. Ultracentrifugation 7. Dialysis and ultrafiltration 8. Affinity chromatography 6. Ultracentrifugation  60000 rpm  应用：纯化、分子量测定。  最常用方法：密度梯度离心。 (density gradient centrifugation)  超速离心原理：蛋白质颗粒的沉降取决于分子 的质量和密度。质量和密度大的颗粒比小的颗 粒沉降的快，当颗粒沉降到与自身密度相等的 介质密度梯度时，就停止不前。  常用的密度梯度：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度等。 Density Gradient Centrifugation （密度梯度离心） 7. Dialysis and ultrafiltration  透析和超滤原理：利用蛋白质分子不能通过 半透膜的性质。  半透膜：玻璃纸、火棉纸、改性纤维素。  应用： 将蛋白质与其他小分子物质分开 浓缩和脱盐 粗分离 Dialysis (透析) Ultrafiltration (超过滤) 8. Affinity chromatography （亲和色谱）  Principle: Many proteins can bind specific molecules (ligand) tightly.  Ligand is covalently attached to an inert matrix.  A significant purification method.  Immunoaffinity chromatography (免疫亲和 色谱) ligand = antibody His-tag （组氨酸标签）  为5-15 His 串在一起的小肽（His6最为常 用）。  一种亲和性tag，通过固定金属离子的亲和 色谱 （IMAC），用于表达纯化。  其他用途： 增加蛋白可溶性。 提高蛋白稳定性。 蛋白质分离纯化全过程 机械破碎 细胞破碎 动(植)物组织 浆状物 低速离心 分级盐析 蛋白混合物 蛋白粗溶液 (除膜等杂质) 高速离心 蛋白沉淀 溶解 蛋白液 层析提纯 纯稀蛋白液