new第7章蛋白质的分离纯化和表征摘要.ppt

主要介绍蛋白质的分离、纯化的一般原则和方法 分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异生物学亲和力 沉淀方法类别: 1、高浓度中性盐（盐析、盐溶） 2、酸碱（等电点沉淀） 3、有机溶剂沉淀 4、重金属盐类沉淀 5、生物碱试剂和某些酸类沉淀 6、加热变性沉淀 　重金属指比重大于5的金属（一般指密度大于4.5g/cm3的金属）。重金属指的是原子量大于55的金属 铜、铅、锌、铁、钴、镍、锰、镉、汞、钨、钼、金、银等 重金属阳离子可以和蛋白质中游离的羧基形成不溶性的盐 立即服用大量鲜牛奶或蛋清和豆浆,可使重金属跟牛奶、蛋清、豆浆中的蛋白质发生变性作用，从而减轻重金属对机体的危害。 水化膜被剥离 某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性 二、 蛋白质的分离纯化 蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度（purity）或比活（specific activity），以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性（以活力单位数/克蛋白质表示）。 设法除去变性的和不要的蛋白质，并且希望所得蛋白质的产量达到最高值。 （一）透析和超过滤 图 7-6 利用压力和离心力的超过滤 (二)凝胶过滤——分子排阻 在等电时，中性盐（K2SO4)对一氧化碳血红蛋白的溶解度的影响 区带电泳 根据支持物的物理性质分为： ①滤纸电泳和薄膜电泳 ②粉末电泳：淀粉、纤维素功硅胶粉等 ③细丝电泳：人造丝、尼龙丝等细丝支持物上的电泳 ④ 凝胶电泳：最常用的有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶 水平式平板凝胶电泳 垂直式平板凝胶电泳 SDS-凝胶电泳谱 等电聚焦（IEF）电泳 蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行的 pH梯度制作一般利用两性电解质在外电场作用下，自然形成pH梯度。 毛细管电泳 电泳是在微内径管(一般为50um内径和300um外径)中进行 (五) 层析 层析种类： 凝胶过滤（分子筛） 离子交换层析（阴离子和阳离子） 亲和层析 凝胶过滤法测定相对分子质量 利用凝胶过滤（gel filtration）可以把蛋白质混合物按分子的大小分离开来。这种方法比较简便，不要求复杂的仪器就能相当精确地测出蛋白质的相对分子质量 如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径，称蛋白质分子的斯托克半径 1966年Andrews根据他的实验结果提出了一个经验公式 图7-4 洗脱体积与相对分子质量的关系 洗脱曲线 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 电泳时，大分子的迁移率决定于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率（e1ectrophoretic mobility）主要取决于它的相对分子质量，而与原来所带的电荷和分子形状无关 SDS在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4克SDS／l克蛋白质，相当于每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。 SDS与蛋白质的结合： 第一，由于SDS是阴离子，使多肽链覆盖上相同密度的负电荷，该电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的SDS-蛋白质复合体，电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动。 第二，改变了蛋白质单体分子的构象，SDS-蛋白质复合体在水溶液中的形状被认为是近似雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合体的短轴长度（直径）都是一样的约为1.8nm，而长轴长度则随蛋白质的相对分子质量成正比例变化 电泳迁移率与多肽链分子量的对数有下列关系 a和b 、 K1 和 K2都是常数 以几种相对分子量已知的标准蛋白质的Mr的对数值对μR作图，根据待测样品的μR ，从其标准曲线上查出分子量 SDS-凝胶电泳谱 四、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 （一）蛋白质含量测定 1.凯氏定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 若以甘氨酸为例，其反应式如下： ? ? CH2COOH? ? |? ?? ?? ?? ?+ 3H2SO4? ? 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3? ? (1)? ? NH2? ? 2NH3 + H2SO4??? ?(NH4)2SO4?