6章 蛋白质的分离纯化和表征-教学用[精].ppt

掌握蛋白质的酸碱性质。 掌握测定蛋白质相对分子质量的常用方法。 掌握蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀的方法和原理。 掌握蛋白质分离纯化的一般原则。 熟悉蛋白质分离纯化的常用方法。 掌握蛋白质含量测定与纯度鉴定的常用方法。 （三）沉降速度法测定相对分子质量 直接测定蛋白质Mr的方法：渗透压法、光散射法、沉降速度法、沉降平衡法和黏度法等，沉降速度法是经典的常用方法. 超速离心机最大转速: 60000～80 000r/min, 相当于位于距转轴中心10 cm处、单位质量(1g)分子所受到的离心力(离心场强度)为400 000 ×g～700 000 ×g. 沉降速度与蛋白质分子大小、密度和形状有关,且与溶剂密度和黏度有关. 单位离心场强度的沉降速度称为沉降系数, 用s(小写)表示: 从轴心到沉降界面的径向距离(cm) 时间 离心角速度(rad/s): 转速(r/min) ×2π/ 60 （三）沉降速度法测定相对分子质量 蛋白质、核酸、核糖体和病毒等的沉降系数：1 ×10-13~200 ×10-13秒范围. 把l0-13s 作为一个单位, 斯维得贝格单位(Svedberg unit)或称沉降系数单位, 用S(大写)表示. 例如人血红蛋白: 4.46S, 即4.46 ×10-13s。 蛋白质的沉降系数(s)与相对分子质量(Mr)的关系可用斯维得贝格方程表达: 摩尔气体常数(8.314J·K-1·mol-1); 热力学温度(K),旧称绝对温度 蛋白质的扩散系数(cm2/s), 数值上等于当浓度梯度为1个单位时在1 s内通过1 cm2面积的蛋白质质量 溶剂的密度(g/cm3) 偏微比体积(cm3/g) 又称偏微比容,蛋白质溶于水的偏微比容约0.74 cm3/g 沉降系数 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 常用电泳法(IEE、PAGE和SDS)、HPLC法、免疫学方法等. 此外, N-末端分析也用于纯度鉴定 (一) 蛋白质含量测定 凯氏定氮法：已不多用 Folin-酚试剂法(Lowry法): 基于Cu2+→Cu+ 双缩脲法 紫外吸收法: 精确度不高,操作简便, 样品可回收, 适用于核酸测定 染料结合法(Bradfold法): 考马斯亮蓝G-250结合法, 灵敏度高(1μg), BCA法: 新开发的,碱性条件, 4,4′-二羧-2,2′-二醌(CBA)与Cu+形成紫色复合物, 反应比Folin-酚试剂更强 生物活性测定法: 利用酶或激素特有的活性测定 抗原-抗体法: 没特异生物学活性的蛋白,注入动物体内产生抗体, 利用抗原-抗体反应测定蛋白含量 生物学活性测定和总蛋白量测定配合: 鉴定纯化程度(比活力) (二) 蛋白质纯度鉴定 * 蛋白质的通性、 纯化和表征 第 6章 一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 教学内容 一、蛋白质的酸碱性质 对某种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH，蛋白质的等电点。 蛋白质的等电点 有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离基团结合，影响等电点。 无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液pH称为等离子点(isoionic point,或称等离点)。等离子点是每种蛋白质的一个特征常数。 一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 教学内容 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 (一) 蛋白质胶体性质 (二) 蛋白质沉淀 分散相质点在1～l00 nm范围内, 在动力学上是稳定的, 介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零, 使它能在介质中作不断的布朗运动; 分散相质点带有同种符号的净电荷,互相排斥,不易聚集成大颗粒而沉淀; 分散相质点能与溶剂形成溶剂化层,例如与水形成水化层,质点有了水化层,相互间不易靠拢而聚集.　　 (一)蛋白质胶体性质 分散相质点在胶体系统中保持稳定的3个条件: 蛋白质溶液,稳定的亲水胶体: 亲水基团与水发生水化作用；某一pH下相同电荷。也有丁大尔现象、布朗运动以及不能透过半透膜性质 蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关, 影响这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性：加人脱水剂以除去它的水化层；改变溶液的pH达到蛋白质等电点使质点的净电荷为零，蛋白质分子则聚集成大的颗粒而沉淀。　　 (二)蛋白质沉淀 沉淀蛋白质的方法有以下几种: 盐析法：中