蛋白质的分离、纯化和表征.ppt

7.5.3.2聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyacrylamideGelElectrophoresis(PAGE)有时用不连续的胶（浓缩胶与分离胶）不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳有3种物理作用：1.样品的浓缩效应2.分子筛效应3.电荷效应蛋白质的分离纯化方法PolyacrylamideGelElectrophoresis(PAGE)Thegreaterthenetchargethefasterthemoleculewillmove.InPAGEtheelectrophoreticseparationiscarriedoutinagelwhichservesasamolecularsieve.Smallmoleculesmovereadilythroughtheporesinthegel,whereaslargermoleculesareretarded.Theporesizesinthegelcanbecontrolledbychoosingappropriateconcentrationsofacrylamide（丙烯酰胺）andthecross-linkingreagent,methylenebisacrylamide（甲叉双丙烯酰胺）.Thehighertheconcentrationofacrylamideused,thesmallertheporessizeinthefinalgel.12SDS原理蛋白质的分离纯化方法Acrylamid丙烯酰胺N’,N’methylenebisacrylamideN’，N’-甲叉双丙烯酰胺蛋白质的分离纯化方法SDS原理聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％－30％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3-4％的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于等电聚焦或作为PAGE电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA。高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10％－20％的凝胶常用于PAGE电泳的分离胶。321SDSInsodiumdodecylsulfate(SDS),theproteinsaredenaturedandcoatedwithanoverallnegativecharge(duetoboundSDS)andthusthebasisfortheirseparationisonlytheirmassSDSTheproteinmixtureisfirsttreatedwithareducingagentsuchas2-mercaptoethanol（巯基乙醇）ordithiothreitol（二硫叔糖醇）tobreakallthedisulfidebonds.ThestronganionicdetergentSDSisthenaddedwhichdisruptsnearlyallthenoncovalentinteractionsintheprotein,unfoldingthepolypeptidechain.SDSApproximatelyonemoleculeofSDSbindsviaitshydrophobicalkyl（烷基）chaintothepolypeptidebackboneforeverytwoaminoacidresidues,whichgivesthedenaturedproteinalargenetnegativechargethatisproportional(成比例的)toitsmass蛋白质的分离纯化方法7.5.3.3毛细管电泳CapillaryElectrophoresis01电泳是在微内径管（一般为50um内径和300um外径）内进行的.02一般管长50—100cm，电压10—50kV，时间10—30min。03蛋白质的分离纯化方法04CapillaryElectrophoresis虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而电渗作用(electroendosmo