章蛋白质的分离纯化和表征教学用.pptx

一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定;一、蛋白质的酸碱性质;对某种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH，蛋白质的等电点。;一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定;二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀;分散相质点在1～l00 nm范围内, 在动力学上是稳定的, 介质分子对这种质点碰撞的合力不等于零, 使它能在介质中作不断的布朗运动; 分散相质点带有同种符号的净电荷,互相排斥,不易聚集成大颗粒而沉淀; 分散相质点能与溶剂形成溶剂化层,例如与水形成水化层,质点有了水化层,相互间不易靠拢而聚集.　　;蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关, 影响这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性：加人脱水剂以除去它的水化层；改变溶液的pH达到蛋白质等电点使质点的净电荷为零，蛋白质分子则聚集成大的颗粒而沉淀。　　;沉淀蛋白质的方法有以下几种:;一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定;三、蛋白质分离纯化的一般原则;动物材料剔除结缔组织、脂肪组织; 种子材料应先去壳和种皮以免受单宁等物质的污染, 油料种子脱脂. 选择适当方法,破碎组织或细胞：动物组织(电动捣碎机或匀浆器或超声); 植物组织(英砂或玻璃粉和适当的缓冲液研磨或用纤维素酶); 细菌细胞(超声,与砂研磨或溶菌酶). 选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来. 如果蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的, 用超声波或去污剂使膜结构解聚, 用适当的介质提取。;(2)粗分级分离: 常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用???过滤或凝胶过滤等方法。 (3)细分级分离: 各种层析、电泳巧妙配合, 后期可 用结晶法。;一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定;四、蛋白质的分离纯化方法;常用凝胶：交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖（sepharose 或 Bio-Gel A）； 凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外，即分级分离范围或排阻极限; 大分子从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小。小分子在颗粒网状结构洗脱历程长，后洗脱下来，洗脱体积大； 用洗脱体积同标准分子量的蛋白质的比例关系测定蛋白质分子量；;Vt: 柱床总体积，常称柱床体积； V0 ：为孔隙体积或外水体积，测出不被凝胶滞留的蓝色葡聚糖-2000的洗脱体积即为V0; Vi ：内水体积，凝胶珠内部的水相体积； Vm ：为凝胶基质体积； Vt=V0+Vi+Vm Ve某一待分离物质组分的洗脱体积,自加样品开始到该组分的洗脱峰(峰顶)出现时所流出的体积； 各组分的流出顺序，可用分配系数Kd来量度： Kd=(Ve－Vo)/Vi。;几个要说明的问题;(三)盐溶和盐析;(四)有机溶剂分级分离法;电泳：在外电场的作用下,带电颗粒,例如带电的蛋白质分子,将向着与其电荷符号相反的电极移动,这种现象称为电泳(electrophoresis)或离子泳(ionophoresis)。;带电颗粒在电场中泳动时,受到两种方向相反的作用力:;A stable pH gradient is established in the gel after application of an electric field.;First dimension Isoelectric focusing;利用蛋白质分子对其配体(或称为配基)分子特有的识别能力建立起来的纯化方法. 将特异配体共价地连接到像琼脂糖凝胶这类载体表面的官能团(如-OH)上，配体和多糖载体之间插人一段长度适当的连接臂 (如ε-氨基己酸)，使配体与凝胶之间保持足够的距离，不致因载体表面的位阻妨碍待分离的分子与配体结合. 这类载体在其他性能方面允许蛋白质能自由通过.;是离子交换层析、凝胶过滤、吸附层析和分配层析等技术的新发展. 对柱层析来说,固相载体的颗粒愈小、分辨率愈高, 但是洗脱液的流速也愈慢。采取高压和机械性能强、化学性能稳定、颗粒度细小而均匀的载体和其他设备自动完成分离纯化. HPLC可用于蛋白质、氨基酸及其他生物分子的分析和制备。;一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的胶体性质与蛋白质