第三章蛋白质化学5蛋白质的分离、纯化和表征2010.ppt

电泳类型：普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳 从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳 从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。 从支持物分： 自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等） 一、蛋白质含量的测定 1) 凯氏定氮法：灵敏度较低 2) 双缩脲法：样品量0.2-1.7mg/L 3) Folin-Lowry法： 在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合物呈绿色，在650nm具有特定的吸收。灵敏度较高25?g-250?g/ml。 BCA法 4) 考马斯亮蓝法（Bradford法）考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化合物，在595nm具有特定吸收，反应简便、快速、灵敏度高，5-50 ?g/ml。 5) 紫外吸收法 由于核酸在260nm具有光吸收，对测定干扰较大，可采用280nm、260nm同测法。 蛋白质浓度mg/ml＝1.45A280-0.74A260 蛋白质的定量法比较 克氏(Kjeldahl)定氮法: 经典的标准方法，现已不多用。 双缩脲(biuret)法: 常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。 Folin-酚（Lowry）法: 蛋白质标准测定方法。 紫外法: 虽然精确度不高，但操作简单，样品可以回收。 Bradford法: 灵敏度高，能检测一个微克的蛋白，重复性好。 BCA (bicinchoninic acid)法: FDA唯一认可 蛋白质的纯度鉴定 基本手段： 电泳分析：单条带。 N端测定：n亚基蛋白有1-n个N端aa。 选用手段： 沉降分析：纯的蛋白质在离心场中以单一的沉降速度移动。 溶解度分析： 结晶分析（能结晶的一般比较纯，具有活性） 蛋白质的溶解度分析 纯的蛋白质在一定的溶剂系统中具有恒定的溶解度，而不依赖于存在于溶液中未溶解固体的数量。 如果蛋白质制品是纯的，那么溶解度曲线只呈现一个折点；不纯的蛋白质的溶解曲线常常呈现2个或2个以上的折点。 蛋白质的纯度鉴定 作业 1.透析、超滤、盐溶、盐析、亲和层析、电泳。 2.如何理解分子筛分离pr的原理。 3.据支持物不同，电泳可分为哪几种类型？ 4.哪些物质可作用蛋白质亲和层析的配体？ 5.测定pr分子量有哪些方法？ 6.蛋白质分离纯化有哪些方法，简述各方法的原理。 7.测定蛋白质含量有哪些方法？ 影响蛋白质溶解度的外部因素： 1）溶液的pH 2）离子强度 3）介电常数 4）温度 二、 利用溶解度差异的分离方法 溶解度归根结底取决于它们本身的分子结构 蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。 若无外加条件，蛋白质不致互相凝集; 除掉这两个稳定因素,蛋白质便容易凝集析出。 2、蛋白质的盐溶和盐析 盐溶：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。 蛋白质分子吸附某种盐类离子，带电层使其互相排斥。 盐析：蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀。 盐溶：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。 蛋白质分子吸附某种盐类离子，带电层使其互相排斥。 盐析：蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀。 3、有机溶剂分级法 在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，降低介电常数使蛋白质的溶解度降低而沉淀。 有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，低温下或缩短处理时间可防止或减缓变性。 常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。 聚乙二醇：脱去蛋白质的水化层。 4、温度对蛋白质溶解度的影响 1、电泳 三、根据电荷不同的分离方法 在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。 蛋白质溶液的pH值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷。 在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)、所带的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f) 界面移动电泳图解 水平平板电泳槽 垂直板电泳槽 圆盘电泳槽 2、离子交换层析 利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 1）纤维素离子交换剂 交换容量大于树脂、洗脱条件温和、品种较多。 2）交联葡聚糖离子交换剂