DB22_T2623.3-2017_黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第3部分：SRAP法_吉林省.docx
ICS65.020.01
B05
DB22
备案号：56324-2017
吉林省地方标准
DB22/T2623.3—2017
黑木耳菌种区别性及真实性鉴定
第3部分：SRAP法
VerificationofdistinctnessandgenuinenessforBlackwoodearspawn
Part3:SRAP
吉林省质量技术监督局发布
DB22/T2623.3—2017
前言
《黑木耳菌种区别性及真实性鉴定》分为以下3个部分：
——DB22/T2623.1黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第1部分对峙培养法
——DB22/T2623.2黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第2部分酯酶同工酶法
——DB22/T2623.3黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第3部分SRAP法
本部分为第3部分：SRAP法。
本标准按照GB/T1.1—2009和GB/T20001.4—2015给出的规则起草。
本标准由吉林省农业委员会提出并归口。
本标准起草单位：吉林农业大学、吉林省海外农业投资开发集团有限公司。
本标准主要起草人：姚方杰、张友民、方明、陈影、鲁丽鑫、王鹏、姚允武、于娅、刘宏宇、李丹、
王晓娥、陈艳秋、刘迪、张伟彤、孔祥会、马晓旭、张媛媛、李玉。
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DB22/T2623.3—2017
黑木耳菌种区别性及真实性鉴定第3部分：SRAP法
1范围
本标准规定了黑木耳菌种真实性SRAP法的原理、试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤、试验数
据处理。
本标准适用于黑木耳菌种真实性鉴定。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1
2.2
2.3
引物primer
适用于黑木耳菌株真实性鉴定的一定长度和顺序的寡核苷酸链。
PCR空白对照PCRcontrolcheck
以无菌水作为模板进行PCR反应，以验证PCR反应过程中是否发生污染。
阴性提取对照negativecontrol
对黑木耳菌种的ORFs区域中内含子、启动子进行特异扩增，检测和比较该序列长度多态性。通过对
PCR产物的检测和比较，识别黑木耳菌种基因组DNA的多态片段，鉴定菌种的真实性。
4.91mol/LTris-HCl(pH8.0)：见附录B.1。
4.100.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)溶液：见附录B.2。
4.11CTAB提取缓冲液：见附录B.3。
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DB22/T2623.3—2017
4.12CTAB纯化缓冲液：见附录B.4。
4.13氯仿异戊醇（24:1）：见附录B.5。
4.14酚-氯仿异戊醇（25:24:1）：见附录B.6。
4.1570%乙醇溶液：见附录B.7。
4.1630%丙烯酰胺溶液：见附录B.8。
4.1710%过硫酸铵：见附录B.9。
4.188%聚丙烯酰胺凝胶溶液：见附录B.10。
4.195×TBE缓冲液：见附录B.11。
4.201×TBE缓冲液：见附录B.12。
4.210.1%硝酸银（AgNO3）溶液：见附录B.13。
4.22显影液：见附录B.14。
4.23液氮。
5仪器设备
5.1PCR扩增仪。
5.2高速冷冻离心机（10000rpm以上）。
5.3紫外分光光度计。
5.4全温摇瓶柜：精度±0.1℃。
5.5凝胶成像系统。
5.6电热恒温水浴槽：精度±0.1℃。
5.7垂直板电泳槽。
直接将接种块接入三角瓶液体培养基中，25℃，120rpm振荡避光培养20d。培养基的制备参见附
录A。
6.2.1菌丝培养量以可做3次平行试验为准，固体方法培养的菌丝，称取0.2g菌丝，液体培养的菌
丝，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分备用，称取菌丝0.5g，置研钵中，在液氮中充分研磨成粉末，
迅速转入1.5mL离心管中，加入650μL65℃预热的CTAB（附录B.3）提取缓冲液。混匀后置于65
℃水浴40min，轻轻地摇动混匀。
6.2.2离心管降至室温，加入等体积的酚-氯仿异戊醇（附录B.6），振荡混匀，4℃，12000rpm离
心15min；将上清液转移至已灭菌的1.5mL离心管中，弃沉淀。
6.2.3加入等体积的氯仿异戊醇（附录B.5），4℃，12000rpm离心15min，将上清液转移至已灭
菌的1.5mL离心管中，弃沉淀。
6.2.4加入2倍体积预冷的无水乙醇，静置沉淀60min，用无菌枪头挑取白色絮状物至干净离心管中，
无水乙醇充分挥发。
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