DB22_T2083-2014_食用菌菌种真实性鉴定RAMP法_吉林省.docx
ICS65.020
B61
DB22
吉
林
省地方
标
准
DB22/T2083—2014
食用菌菌种真实性鉴定RAMP法
Verificationofgenuinenessforediblemushroomspawn—RAMP
吉林省质量技术监督局
发布
DB22/T2083—2014
前
言
本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。
本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本标准由吉林省农业委员会提出并归口。
本标准起草单位：吉林农业大学。
本标准主要起草人：宋慧、刘晓龙、金周雨、汤海峰、宗立立、李雨婷、王健、谭旭华、李艳丽。
I
DB22/T2083—2014
食用菌菌种真实性鉴定RAMP法
1范围
本标准规定了利用RAMP技术鉴定食用菌菌种真实性的分析步骤、结果记录、分析鉴定的方法。
本标准适用于猴头菌（Hericiumerinaceus）、小刺猴头菌（Hericiumcaput-medusae）、珊瑚状
猴头菌（HericiumcoralloidesPers）、黑木耳（Auriculariaauricular）和光帽鳞伞（Pholiotanameko）
食用菌菌种真实性的鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T12728食用菌术语
3.1
随机扩增微卫星DNA多态性标记RandomAmplifiedMicrosatellitePolymorphism（RAMP）
是以1条与微卫星序列互补的SSR引物和1条RAPD随机引物相组合，对基因组中的微卫星序列与
随机引物互补序列之间的DNA片段进行随机扩增的技术。
3.2
供检菌种与对照菌种的符合性
采用RAMP标记扩增基因组中微卫星序列与随机引物互补序列之间的DNA片段，通过比较试样与对照
指纹图谱，从而对菌种进行鉴定。
5仪器设备及试剂
见附录A。
6溶液配制
1
DB22/T2083—2014
见附录B。
7分析步骤
7.1菌丝培养
7.1.1培养基的制备
称取去皮马铃薯200.0g，制备成均匀碎块（约1cm），加蒸馏水1000mL，煮沸30min，滤除固体
3
残渣，在马铃薯汁液中加入葡萄糖20.0g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.46g，磷酸氢二钾1.0g，琼
脂18.0g，加热使其充分溶解，定容至1000mL，pH自然，装入试管，塞好试管塞。121℃-126℃，高压
灭菌30min，摆成斜面冷却后使用。
7.1.2接种
将供检菌株与对照菌株在相同条件下培养，培养量可供做3个平行鉴定试验。将待供检菌株与对照
菌株在无菌条件下，切取（3～5）mm×（3～5）mm大小一块母种，迅速转移至试管斜面培养基中央位
置，每个菌株接种20支～30支试管。
7.1.3恒温培养
将接种后的试管置恒温培养箱中，分别在25℃条件下避光培养黑木耳9d～12d，猴头菌、小刺猴
头菌、珊瑚状猴头菌培养12d～15d；在20℃条件下避光培养光帽鳞伞15d～20d。
7.2.1称取0.1g的菌丝置于无菌研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；
7.2.2将菌丝粉末迅速转移至1.5mL离心管中，加入600μL的65℃预热的CTABDNA提取缓冲液，
置于65℃水浴45～60min，每5min～15min颠倒混匀；
7.2.3加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提10min，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心5min；
7.2.4取上清加等体积氯仿-异戊醇（24:1）抽提10min，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心5min，
重复7.2.4抽提1次；
7.2.5加等体积异丙醇-20℃充分沉淀；
7.2.7加500μL的70%乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥，加40μL的TE缓冲液（pH8.0）溶解；
7.2.8加入10mg/mL的RNase溶液至终浓度达50μg/mL，去除RNA，37℃水浴1h；
7.2.9重复操作7.2.3～7.2.5，加入100μLTE缓冲液（pH8.0），使DNA充分溶解，并置于4℃冰
箱中保存备用
取1%琼脂糖溶液40mL加入4μL的溴化乙锭，缓慢倒入凝胶托盘中冷却，避免出现气泡，插入
梳子，待胶体凝固后