DB22T 2083-2014 食用菌菌种真实性鉴定 RAMP 法.docx

ICS65.020B61

备案号：42283-2014DB22吉林省地方标准

DB22/T2083—2014

食用菌菌种真实性鉴定RAMP法

Verificationofgenuinenessforediblemushroomspawn—RAMP

2014-05-04发布2014-06-01实施

吉林省质量技术监督局发布

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DB22/T2083—2014

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。

本标准起草单位：吉林农业大学。

本标准主要起草人：宋慧、刘晓龙、金周雨、汤海峰、宗立立、李雨婷、王健、谭旭华、李艳丽。

1

DB22/T2083—2014

食用菌菌种真实性鉴定RAMP法

1范围

本标准规定了利用RAMP技术鉴定食用菌菌种真实性的分析步骤、结果记录、分析鉴定的方法。

本标准适用于猴头菌（Hericiumerinaceus）、小刺猴头菌（Hericiumcaput-medusae）、珊瑚状猴头菌（HericiumcoralloidesPers）、黑木耳（Auriculariaauricular）和光帽鳞伞（Pholiotanameko）食用菌菌种真实性的鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T12728食用菌术语

3术语和定义

GB/T12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1

随机扩增微卫星DNA多态性标记RandomAmplifiedMicrosatellitePolymorphism（RAMP）

是以1条与微卫星序列互补的SSR引物和1条RAPD随机引物相组合，对基因组中的微卫星序列与随机引物互补序列之间的DNA片段进行随机扩增的技术。

3.2

菌种真实性VerificationofSpawn供检菌种与对照菌种的符合性

4RAMP标记原理

采用RAMP标记扩增基因组中微卫星序列与随机引物互补序列之间的DNA片段，通过比较试样与对照指纹图谱，从而对菌种进行鉴定。

5仪器设备及试剂见附录A。

6溶液配制

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DB22/T2083—2014见附录B。

7分析步骤

7.1菌丝培养

7.1.1培养基的制备

称取去皮马铃薯200.0g，制备成均匀碎块（约1cm3），加蒸馏水1000mL，煮沸30min，滤除固体残渣，在马铃薯汁液中加入葡萄糖20.0g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.46g，磷酸氢二钾1.0g，琼脂18.0g，加热使其充分溶解，定容至1000mL，pH自然，装入试管，塞好试管塞。121℃-126℃,高压灭菌30min，摆成斜面冷却后使用。

7.1.2接种

将供检菌株与对照菌株在相同条件下培养，培养量可供做3个平行鉴定试验。将待供检菌株与对照菌株在无菌条件下，切取（3～5）mm×（3～5）mm大小一块母种，迅速转移至试管斜面培养基中央位置，每个菌株接种20支～30支试管。

7.1.3恒温培养

将接种后的试管置恒温培养箱中，分别在25℃条件下避光培养黑木耳9d～12d，猴头菌、小刺猴头菌、珊瑚状猴头菌培养12d～15d；在20℃条件下避光培养光帽鳞伞15d～20d。

7.2DNA提取

7.2.1称取0.1g的菌丝置于无菌研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

7.2.2将菌丝粉末迅速转移至1.5mL离心管中，加入600μL的65℃预热的CTABDNA提取缓冲液，置于65℃水浴45～60min，每5min～15min颠倒混匀；

7.2.3加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提10min，颠倒混匀，4℃,12000rpm离心5min；7.2.4取上清加等体积氯仿-异戊醇（24:1）抽提10min，颠倒混匀，4℃,12000rpm离心5min，重复7.2.4抽