5.紫外-可见吸收光谱法规范.ppt

?  第5章 紫外-可见分光光度法 二.紫外-可见分光光度法的特点： 图示 饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*，n→σ* 跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。 不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π* 跃迁，吸收峰一般大于200nm。 （三） 波长的选择 一般根据待测组分的吸收光谱，选择最大吸收波长作为测定波长。 续前 3．对照法：外标一点法 注：当样品溶液与标准品溶液的 稀释倍数相同时 在一定波长处，用2.0 cm吸收池测得某试液的百分透光度为71%，若改用3.0cm吸收池时，该试液的吸光度A为（ ） A. 0.10 B. 0.22 C. 0.45 某化合物浓度为c1，在波长λ1处，用1cm的比色皿测量，求得摩尔吸光系数为ε1，浓度为3c1，在波长λ1处，用3cm的比色皿测量，求得摩尔吸光系数为ε2，则它们的关系是（） A. ε1 = ε2 B. ε2=3ε1 C. ε2＞ ε1 电子能级间隔越小,跃迁时吸收光子的 ( ) (1)能量越大 (2)波长越长 (3)波数越大 (4)频率越高 5.6 紫外-可见吸收光谱的应用示例 紫外-可见吸收光谱主要可用于物质的定量分析，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。 定性分析 纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。 结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。 例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。 苔黑酚法测定酵母中RNA的含量 一、原理 当RNA与苔黑酚(3，5-二羟基甲苯) 在沸水中加热时，RNA被酸降解，所产生的核糖进一步转变为糠醛，它与苔黑酚在高铁离子的催化下可反应生成绿色复合物，后者在670nm处有最大吸收峰，在10～100mg/mL范围内其吸光度值与RNA浓度有线形关系。 二、试剂和器材 1. 试剂 0.1mg/mL标准RNA溶液、苔黑酚试剂、 2. 器材 可见分光光度计、恒温水浴锅 三、操作步骤 1. 标准曲线的绘制 取12只试管分成6组，按下表操作。取2管的平均值，以DNA浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 样品的测定 取待测样品1mL，加蒸馏水1mL及二苯胺溶液2mL，沸水浴保温45min，冷却，然后在670nm波长出测定吸光度值。根据测得的吸光度值，从标准曲线上查得相应的RNA的mg数，按下式计算待测样品的RNA的含量。 RNA%＝ 五、注意事项 样品蛋白质含量高时，应先用5％三氯乙酸沉淀蛋白质；有较多DNA样品时也会发生干扰，可在试剂中加适量的CuCl2·H2O， 可减少DNA的干扰。 本章作业题 1.电子跃迁有哪几种类型,这些类型各处于什么波长范围? 2.何谓助色团、生色团？试举例说明 3.分光光度计由哪些部件组成,各部件的作用是什么? 4.紫外-可见分光光度法通常对哪些分析条件进行选择? A (2) I0 It 光强度的 测量—分光光度计 分光光度法的应用：定量测定与定性分析 物质对光有选择性吸收，与分子结构中电子跃迁有关 光强度的减弱与物质浓度的关系？—朗伯-比尔定律 测量光强度的减弱 back 参考《生物工程分析》80-82页 2 0 2.0 5 吸光度值 混合均匀后，置沸水浴中加热45min，冷却，在670nm波长处比色 2 2 2 2 2 苔黑酚试剂/mL 0.4 0.8 1.2 1.6 2 蒸馏水/mL 1.6 1.2 0.8 0.4 0 标准RNA/mL 4 3 2 1 0 试管 待测样品中测得的RNA的mg数 待测样品液中样品的mg数 X 100 单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。 2 单色器 单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。 3. 样品室 样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。 4. 检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。 5. 结果显示记录系统 检流计