双向电泳技术在蛋白质组学中的应用.doc

双向电泳技术在蛋白质组学中的应用 CN12-1352/N 实　　验　　室　　科　　学LABORATORY　SCIENCE第2期　2009年4月No.2　Apr.2009 双向电泳技术在蛋白质组学中的应用 李　倩,于　振,江　帆,彭永康 3 (天津师范大学化学与生命科学学院、细胞遗传与分子调控天津市重点实验室,天津　300387) 摘　要:双向电泳技术在蛋白质组学研究领域中一直处于核心地位。此文从基本原理、方法、在蛋白质组中的应用以及方法的局限性和相关技术改进等方面做了简要综述,为进一步开发利用该技术提供参考依据。关键词:双向电泳;蛋白质组学;应用 中图分类号:Q291　　文献标识码:B　　文章编号:1672-4305(2009)02-0081-03 Theapplicationoftwo-dimensiinLYJIANGFan,PENGYong-kang (CollegemistryandLifeScience,TinnjinNormalUniversity,Tianjin300387,China)Abstract:Two-dimensionelectrophoresis(2D)isoneofthecoretechnologiesinproteomicresearch. Thebasicprinciple,methods,andtheapplicationofthetechnologyarereviewed,aswell asthatthelimitationandimprovementarealsomadeabriefdiscussion.Thispaperhasprovidedrefer2encestothefurtherutilizationofit. Keywords:two-dimensionalelectrophoresis;proteomics;application 蛋白质组(Proteome)是指一个生物体所表达的全套蛋白质。双向电泳技术作为蛋白质组学三大关键核心技术之一,是唯一能同时将上千种蛋白质同时分离和展示的方法,也是目前分析复杂组份蛋白质分辨率最高的工具,因此受到人们的广泛 [1] 关注。 1.2　双向电泳的技术方法 (1)样品制备 样品制备是决定双向电泳重复性和分http://辨率的关键因素之一,主要通过超声波破碎细胞,再将杂质除去,最后用裂解液溶解蛋白质即可。样品制备时一般要遵循以下原则:①尽可能多地使细胞或组织中的蛋白溶解;防止蛋白质在提取过程中的降解和丢失;尽量去除干扰物质;避免蛋白质被修饰而得到错误的关于其等电点的信息;蛋白质样品与第一向电泳的相容性;为富集特定的蛋白,可以采用不同的样品处理方法。 (2)第一向等电聚焦 1　双向电泳技术的原理及方法 1.1　基本原理 双向电泳技术由Farrel等人于1975年建立。 其基本原理是:第一向进行等电聚焦,因为蛋白质是两性分子,具有不同的等电点,在pH梯度介质中外加电场作用形成分离的蛋白质区带;第二向根据分子量不同进行分离。第一向等电聚焦完成后,将凝胶包埋在SDS凝胶板上端,在垂直或水平方向进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)第二次分离,结果是形成了分离的蛋 [1-2] 白质点,所得蛋白质双维图谱中每个点代表样本中的一个或数个蛋白质,而蛋白质的等电点、分子 [3] 量和在样本中的含量也可显现出来。 3 根据支持介质的不同,等电聚焦可以分为以下三种方法: ISO-DALT:此系统是在聚丙烯酰胺凝胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度。使用载体两性电解质的ISO-DALT可自由决定等电聚焦电泳规模和pH梯度曲线,而且对仪器设备要 资助项目:本文受天津市细胞遗传与分子调控重点实验室开放基金资助。 82 求不高、费用较低,被广泛应用于蛋白质组学研究。其主要缺点是:pH梯度不稳定,存在阴极漂移,上样量低,重复性差,不利于不同批次实验以及不同实验室间进行图谱比较。 IPG-DALT:如果第一向电泳使用丙烯酰胺和固相化的两性电解质共聚,可形成具有pH梯度的凝胶,这种方法称为IPG-DALT系统。IPG-DALT发展于20世纪80年代早期,基本上克服了ISO-DALT系统的缺点,是现在主要和常用的方法。它具有很多优势:由于固相pH梯度(IPG)的出现解决了pH梯度不稳的问题;可以制作线性、渐进性和S型曲线,范围或宽或窄的pH梯度,聚焦准确,精度高,梯度分辨率可以达到0.001pH,目前在一块胶上最多可分离10300多个点;,[2-3] 。 非平衡pH梯度电泳(nonequilibriumpHgra2dientelectrophoresis,NEPhGE):主要用于分离碱性蛋白。如果聚焦达到平衡状态,碱性蛋白会离开凝胶基质造成丢失,且