蛋白质双向电泳及质谱技术.ppt

感谢大家观看第64页,共64页，2024年2月25日，星期天有机荧光团染料包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类，后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等荧光染料可对SDS胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成灵敏度为2~10ng其线性范围为3个数量级在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质金属螯合染料与现代蛋白质组学研究相兼容的专门与常用微量化学表征过程兼容不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合染色方法第32页,共64页，2024年2月25日，星期天凝胶的图像处理分析典型流程凝胶图像的扫描图像加工斑点检测和定量凝胶配比数据分析数据呈递和解释2-DE数据库的建立2-DE分离的可溶性E.coli蛋白第33页,共64页，2024年2月25日，星期天目前双向电泳需解决的问题样品的制备及溶解不溶性蛋白(膜蛋白及核内蛋白)难分离蛋白(如毛发及皮肤中的蛋白)载样量的提高初步分离低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白定量分析灵敏度及可重复性第34页,共64页，2024年2月25日，星期天对于双向电泳的建议首先采用宽pH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常采用pH3-10的胶条如果pH线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶条加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率采用窄pH范围的胶条，提高某pH范围蛋白的分辨率第二向采用梯度胶进行分离去除高丰度蛋白，进行蛋白的分级处理，富集低丰度蛋白第35页,共64页，2024年2月25日，星期天蛋白质质谱技术第36页,共64页，2024年2月25日，星期天质谱基础

样品离子源质量分析器离子检测器固体液体蒸汽形成离子(带电分子)电离质量分选(过滤)检测根据m/z分选离子数据处理质谱检测离子基本步骤:1.样品离子化2.根据质量(m/z)不同分离离子3.检测每种质量离子的数目4.收集、处理数据得到质谱图第37页,共64页，2024年2月25日，星期天质谱的评价指标质量范围速度灵敏度分辨率精确度第38页,共64页，2024年2月25日，星期天+++自由漂移区检测器基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)样品探针激光335nmm/z相对强度MH+MH+MH+特点：灵敏度高准确度高分辨率高质量范围广图谱简明速度快第39页,共64页，2024年2月25日，星期天ESI四级杆质量分析器碰撞室反射器MCP检测器碰撞气体串联质谱法(MS/MS)ESI-Q-TOF质谱仪步骤：1质量分析2碰撞(离子裂解)3质量分析TOF质量分析器第40页,共64页，2024年2月25日，星期天强的抗背景干扰能力极高的检测灵敏度和准确度可用来分析复杂混合物中的蛋白质丰富的检测信息，高通量鉴别蛋白质串联质谱的优点第41页,共64页，2024年2月25日，星期天1、鉴定和注释蛋白质的路线通过肽质谱指纹图（peptidemassfingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配通过串联质谱进行单个或多个蛋白质的鉴定鸟枪法蛋白质组学第42页,共64页，2024年2月25日，星期天1234.5396783.9147375.2561多肽已测得质谱数据或理论质谱数据MALDI-TOF检测的多肽指纹胰酶消化凝胶蛋白质数据库?123比较:??是否相同??质谱3235.2256第43页,共64页，2024年2月25日，星期天肽质谱指纹图在数据库中匹配

不成功的可能原因样品量太少，PMF图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质量不好。2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获PMF图实际上是两个以上蛋白质的混合图。第44页,共64页，2024年2月25日，星期天操作中角蛋白或其他蛋白质的污染蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多未知的新蛋白质数据库规模太小续：第45页,共64页，2024年2月25日，星期天氨基酸序列VLDPNTVFAL蛋白质数据库？查询串联质谱图从头测序输入输出序列片段PNT①②③串联质谱鉴定多肽的计量方法第46