蛋白质的分离纯化及双向电泳.ppt

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TaqDNApolymerase和PfuDNApolymerase的煮沸法纯化第64页,共68页，2024年2月25日，星期天目的：获得纯的，无DNA污染的Taq和pfu聚合酶，用于PCR反应。原理利用Taq和pfu酶耐高温不变性的原理。第65页,共68页，2024年2月25日，星期天操作步骤取1.5ml过夜培养并经IPGE诱导的菌种于离心管中，4000rpm离心5min收集菌体；重复收集1次；用4XTaq或pfubuffer，0.5ml清洗菌体1次；加入100μl4XTaqbuffer,剧烈振荡重悬菌体；第66页,共68页，2024年2月25日，星期天沸水煮沸8min，期间颠倒2-3次；13000rpm,离心30分钟；转上清入新管（约100μl);加入10μl平衡好磷酸二氢钾（pH10.3);加入110μl无水乙醇，振荡10秒，3000rpm，2min;转上清入新管，加100μl无菌甘油，混匀，保存于-20℃备用。第67页,共68页，2024年2月25日，星期天感谢大家观看第68页,共68页，2024年2月25日，星期天**当一束光线透过胶体，从入射光的垂直方向可以观察到胶体里出现的一条光亮的“通路”，这种现象叫丁达尔现象，也叫丁达尔效应（Tyndalleffect）、丁泽尔现象、丁泽尔效应。1827年,英国植物学家布郎(R.Brown,1773-1858)把花粉悬浮在水中,用显微镜观察,发现花粉的小颗粒在作不停地,无秩序的运动,这种现象叫做布郎运动.2．蛋白质的纯化方法利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大小不同，而被吸附到连接有疏水基团的层析介质上。离子强度增大可增强吸附能力，因此常常在2mol/L或3mol/LNaCl溶解样品，洗脱时可通过降低盐浓度、增加乙二醇浓度进行梯度洗脱。正丁基-Sepharose、正辛基-Sepharose苯基-Sepharose?疏水层析第31页,共68页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。亲和层析法第32页,共68页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。亲和层析法第33页,共68页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质溶液的pH值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷。由于不同蛋白质的分子量不同，所带的电荷不同，因而在电场中移动的速度也不相同。在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。第34页,共68页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1?2比例结合。这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，E?q值接近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。?SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法第35页,共68页，2024年2月25日，星期天2．蛋白质的纯化方法将两性电解质(pH3-9,或其它范围的如pH5-7)同蛋白质样品一起加入到已经铺好的凝胶上，在电场下，两性电解质首先达到它的等电点而平衡，蛋白质样品根据它自身的等电点分别向两极移动，最后也达到平衡。?等电聚焦第36页,共68页，2024年2月25日，星期天3.蛋白质含量的测定?定氮法：灵敏度较低?双羧脲法：样品量0.2-1.7mg/L?Folin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm具有特定的吸收。灵敏