基因组DNA提取（年制）().ppt

基因组DNA的提取 原 理 细胞裂解液?裂解组织匀浆 蛋白酶K去除DNA结合蛋白 RNase去除RNA 饱和酚、酚/氯仿纯化DNA 无水乙醇沉淀获得DNA DNA溶解于TE溶液 70%乙醇洗涤DNA、干燥 琼脂糖凝胶电泳鉴定 实验步骤 1、小鼠颈椎脱臼处死，取绿豆大肝组织，放入匀浆器，加入10倍体积TE于冰浴中匀浆后，分装至1.5ml EP管中（400?l/支）。 2、加入10% SDS至终浓度为0.5%（20 ?l）。 3、加入RNase A (10mg/ml)至终浓度为20 ? g/ml（1 ?l）混匀，置37℃水浴60min。 4、加入蛋白酶K（20mg/ml）至终浓度为100?g/ml (2 ?l)混匀，55℃ 水浴2小时。 5、冷却至室温，加等体积饱和酚（450 ?l）充分颠倒混匀，12000rpm离心5min。 6、吸取上层水相移至另一干净EP管中，加入等体积酚/氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心5min。 7、吸取上清移至另一干净EP管中，加入0.2倍体积5M KAc和2倍体积冷无水乙醇混匀，静置5分钟，12000rpm离心5min。 8、弃上清，用0.5ml 70% 乙醇洗涤DNA，弃上清，倒置干燥。 9、 加入10 ?l TE溶解DNA。 10、加入2 ?l 6×loading buffer，充分混匀，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋白质和脂类物质，能使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来。 KAc增加盐离子浓度，使DNA充分沉淀 基因组DNA提取，抑制DNase活力很容易，但防止机械剪切力拉断更为重要。 用EDTA、Dnase抑制剂、蛋白变性剂、去垢剂等都可以使DNase 失活。