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实验一 CTAB 法提取植物基因组DNA 实验目的： 学习从植物组织中（幼叶）提取基因组 DNA 勺基本原理和方法。 实验原理： 采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤 其是氧化酶类），其对DNA 勺抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲液中需加入抗氧 化剂或强还原剂（如筑基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨， 材料易于破 碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB （hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基漠化铉），是 一 种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐的溶液中 （＞0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去 除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀（CTAB^溶于乙醇）即可使核酸分离出来。 CTA®液在低于15 度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材料中 之 前必须预热（65 度），且离心温度不要低于15 度。 实验步骤： 1、取幼嫩的植物叶片（3-5g ）剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml 离心管内。加 入 等体积的65C 预热的DN 靛取缓冲液置于65C 的恒温水浴摇床上1-2h （1.5h）。 2、加入等体积的氯仿：异戊醇（24 : 1）,轻轻上下颠倒5 分钟，静置5 分钟，之 后于12000rpm 离心10 分钟。 3、吸取上层水相，重复步骤2 一次。 4、吸取上层水相，加入预冷2/3 体积的异丙醇，轻缓颠倒2 分钟并置-20C 冰 箱 内10min,待DN 质淀后于12000rpm 离心收集，收集的DN 舟70 忍醇中洗2-3 次。将 弃去乙醇风十后的DNA1 口适量水使其溶解。 5、 待DN 虎全溶解后加入1-2 l 不含RNAaseA （ 10mg/ml ）, 37C 保温1h 以除 去DN 冲的RNA 6、于 Eppendorf 管中加入 1mlM 仿：异戊醇（24: 1）轻轻上下颠倒 10 分钟后 10000rpmW 心 10 分钟。 7、吸取上层水相并先后加入1/10 体积的3M®昔酸钠及2 倍总体积的预冷的无水 乙醇，接着置于-20 C 冰箱，10 分钟后10000rpm 离心10 分钟，弃去无水乙醇，加 入 70%乙醇洗涤2-3 次，风十，最后将DN 格于适量（ 200-500 l ） TE 中。 8、待DN 席全溶解后进行1 商脂糖凝胶电泳，检查DN 啊质量并据已知的DNA 分子量标准估计其浓度。调整浓度后的 DN 席丁-20 C 备用。 实验试剂： 1、1M Tris-HCL (pH8.0) 121.1g Tris 溶丁800ml 无菌水中，加浓HC 调pH®8.0 ,定容至1L,高压灭菌 2、0.5M EDTA (pH8.0) 186.1g EDTA-Na 2HO 容丁800ml 无菌水中，需用磁力搅拌器剧烈搅动，用 NaOHIpbfi 到8.0 (约20g)，定容至1L,高压灭菌。 3、3.5M NaCL 204.75g NaCL 溶丁 1L 无菌水中，高压灭菌。 4、10% CTA 防液 10gCTA 密丁 80ml 无菌水中，定容至100mL 高压灭菌。 5、DN 醒取液(500ml) 6、 氯仿- 3.5M NaCL 200ml 异戊 Tris-HCL 50ml (24:1 体积比) EDTA 50ml 7、RNAaseA 10%3TAB 100ml