实验一细菌基因组DNA的提取.ppt

细菌基因组DNA的提取 一、实验原理 1、核酸的分类 DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。 2、核酸制备的一般原则 核酸制备的步骤： 破碎细胞 提取 纯化 细胞破碎 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 DNA提取 SDS（十二烷基硫酸钠 ）法 ：SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵 ）法 ：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。 DNA纯化（去杂质） 蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA ：常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1％PVP。 核酸提取的一般过程 核酸样品的保存 温度： 4℃（5℃）最佳和最简单 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 二、材料、设备及试剂 菌种 ：大肠杆菌DH5α 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器，水浴锅（ 37℃ 、60 ℃ ） 试剂：LB液体培养基 、无水乙醇、细菌基因组DNA提取试剂盒。 1、细菌 37℃ 过夜培养，取1ml培养物 12000rpm 室温离心 1min。 2、沉淀物加入180ul TE缓冲液，充分重悬细菌；再加入20ul 50mg/ml溶菌酶，混匀后于30℃温育10min。 3、12000rpm 离心 5min, 弃上清后加入200 ul Buffer BTL，漩涡震荡悬浮细胞。 4、加入25ul 蛋白酶K溶液，振荡器混匀，于55℃温育30min，每隔10min 漩涡震荡一次。 5、加入220ul Buffer BDL，颠倒混匀，于65℃温育10min。 6、加入220ul 无水乙醇，以最大速度漩涡震荡20s。 7、转移样品至DNA 纯化柱中，纯化柱下端安装2ml收集管,12000rpm离心1min使DNA结合在纯化柱上，弃去收集管。 8、将DNA纯化柱安装到新的2ml收集管中，加入500ul Buffer HB，12000rpm离心1min，弃去滤液。 9、DNA纯化柱中加入700ul DNA Wash Buffer，12000rpm离心1min，弃去滤液。 10、重复步骤9一次。12000rpm离心2min，干燥DNA纯化柱。 11、将DNA纯化柱转移至1.5ml EP管中，加入50ul 预热（65℃）的Elution Buffer, 室温放置3min，12000rpm离心1min。 三、操作步骤 四、注意事项——材料准备 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 四、注意事项——细胞裂解 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 动物组织－－匀浆或液氮研磨 组培细胞－－蛋白酶K 细菌－－溶菌酶破壁 酵母－－破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡