细菌基因组DNA的提取.ppt

实验一细菌基因组DNA的提取一、实验原理1、核酸的分类DNA主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。实验原理核酸制备的一般原则分离纯化核酸总的原则：应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。核酸纯化应达到的要求：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染。实验原理核酸制备的一般原则核酸制备时应注意的事项:尽量简化操作步骤，缩短提取过程。减少化学因素对核酸的降解。减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温防止核酸的生物降解。提取纯化核酸制备的步骤：破碎细胞I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质一、实验原理核酸制备的一般方法和原理核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。核酸酶的抑制和抑制剂DNase抑制加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。核酸酶的抑制和抑制剂#2022单击此处添加大标题内容如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；对RNase、DNase有一定的抑制作用。单击此处添加大标题内容如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC核酸制备中常用的蛋白质变性剂蛋白质变性剂的作用：使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。核酸制备中常用的酶DNase01RNase02蛋白酶K03溶菌酶04核酸提取的一般过程01040205添加标题破碎细胞（防止核酸酶的作用）添加标题酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，添加标题微生物：溶菌酶、SDS裂解。添加标题冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。0708添加标题细胞器DNA：首先纯化细胞器。添加标题以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂0306添加标题高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。添加标题动物：液氮处理后用匀浆器破碎。核酸提取的一般过程破碎抽提核酸除去杂质首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离使核酸与蛋白质分离除去脂类多糖的除去核酸提取的一般过程核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4℃（5℃）最佳和最简单70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存20℃保存保存介质：TE缓冲溶液(最常用)TE缓冲液被用于DNA的稳定和储存10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0材料、设备及试剂菌种：DBT降解菌设备：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，涡旋振荡器试剂：LB液体培养基、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5MNaCl、Tris-饱和酚、氯仿、RNA酶A、无水乙醇三、操作步骤1.5ml菌液（每组两管）4℃12000rpm离心30sec，弃去上清，倒置试管于吸水纸上吸干。每管加入400μl裂解液，用移液枪枪头反复抽吸辅助裂解，37℃水浴30min。每管加入132μl的5MNaCl溶液，颠倒试管，充分混匀后，13000rpm离心15min。用粗口的枪头（用剪刀剪去1ml枪头的尖端）小心取出