细菌基因组的DNA提取.ppt

核酸制备的步骤： 核酸提取的一般过程 细胞破碎 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 DNA提取 SDS（十二烷基硫酸钠 ）法 ：SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵 ）法 ：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。 DNA纯化（去杂质） 蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA ：常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1％PVP。 三、操作步骤 1、培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.2ml的培养物离心12000rpm,1min。 2、沉淀物加入570ul的无菌水（或TE）缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入30ul 10%的SDS和10ul 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h，（加入3ul的溶菌酶50mg/ml效果更好）。 3、加入100ul 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀，于60 ℃温育10min。(上下颠倒混匀)，离心，12000rpm,5min。 4、取上清，加入等体积（约800ul）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，离心12000rpm,5min，将上清液转至新管中。（抽提两次） 5、加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，静止10分钟，离心,12000rpm,10min 。 6、沉淀用1ml的75%乙醇中洗涤，离心5min，弃上清液，重悬于30ul的无菌水（或TE）缓冲液。 四、注意事项——材料准备 四、注意事项——细胞裂解 四、注意事项——核酸分离、纯化 四、注意事项——核酸沉淀、溶解 * 细菌基因组DNA的提取 一、实验原理 1、核酸的分类 DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。 2、核酸制备的一般原则 核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取时间。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。 破碎细胞 提取 纯化 核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。 3、核酸制备的一般方法和原理 DNase抑制 ①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。 RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。 核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核小体上的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。 如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠 核酸制备中常用的蛋白质变性剂 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造