大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化.pdf

中国试剂网 3.13.11.17 大肠杆菌感受态的制备及重组 DNA 的转化 1．感受态的制备 （1）接种单菌落于2ml LB 培养液中， 37 ℃过夜。 （2 ）取0.25ml 过夜菌入 25ml LB 培养液中，37℃振摇4～6h 至 A590=0.4～ 0.6 。 （3 ）倒入50ml 管内，水浴 10min，以2500～3000rpm 离心 5min，弃上清。 （4 ）缓慢加入75mmol/L 预冷 CaCl25ml 悬浮菌体，冰浴 20min ，同上离心 弃上清。 （5 ）缓慢加入 75mmol/L 预冷 CaCl21.0ml 轻轻混匀后分装在 1.5ml Eppendorf 管中，每管 200 μl，冰浴 1～2h 。 2 ．重组DNA 的转化 （1）将3 只 Eppendorf 管按下列转化项目作好标记： （2 ）冰浴30min 至 1h。中间摇动3 次，以防受体菌沉底。 （3 ）42 ℃90s 。 （4 ）37℃水浴 5min 。 （5 ）加入无相应抗生素的Lb 200 μl，混匀后，37℃水浴 30～60min 。 （6 ）分别取3 组反应物各 50 μl 在含相应抗生素的固体 LB 培养基平皿上涂 布，室温下干燥，然后倒置于 37℃温箱中培养过夜。