分子生物学实验五 大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化.ppt

大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化 实验目的 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。 3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法 感受态细胞： CaCl2处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。 影响转化率的因素 细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。 所用实验仪器 实验试剂 ? 大肠杆菌JM109 ? LB培养基， ? 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） ? 氨苄青霉素 pUC18质粒 实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化 菌株活化 1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌JM109，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养12-16小时 2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养12-16小时 3．将培养液全按1:100转到50mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4 转化（1）取3只灭菌的Ep管，分别编号1、2、3、分别加入以下各组分：加入10～20ng质粒DNA（体积小于10ul），同时做两个对照组： 1号：受体菌对照组： 100ul感受态细胞悬浮液+2ul无菌ddH2O 2号：质粒DNA对照组：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19 3号：正常转化组：100ul感受态细胞悬浮液+2ul pUC19 实验报告 请将自己的实验结果拍照并做分析，不需要计算转化效率。 * * 实验原理 转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰 系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和 甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 超净工作台 离心设备 台式高速冷冻离心机 恒温空气摇床 恒温培养箱 培养皿 感受态细胞制备 1．4℃，12000 rpm，离心2 min，以回收细菌。 2.每管加1ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞,冰浴2分钟。 3. 4℃，12000 rpm，2 min。 4.倒净上清液，倒置离心管1min，使残留液流尽。每管加100 ul冰预冷的0.1 mol/L CaCl2重新悬浮细胞（重悬时操作要轻），冰浴5分钟即成感受态细胞悬浮液。 BACK 注意:每10人做一组对照 （2）轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min。 （3）转入42℃水浴2min。 （4）迅速转入冰上冷却2min，修复细胞膜。 （5）加600ul无抗生素LB液体培养基，摇匀后于37℃，200 rpm，振荡60min。使受体菌恢复正常生长状态，并且表达Ampicillin抗性基因。 （6）取200UL菌液涂板,置于37℃恒温培养箱倒置培养12－16h后观察结果 ,照相后清洗培养皿. 实验结果 *