大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(JinLab).docx

大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法 (Jin Quan-Wen Lab at XMU) 一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备： 第一天： 用枪头或接种环挑取单克隆菌落，接种入盛有5ml LB 液体培养基的培养管中， 可以准备两管。37?C，220rpm，培养过夜（14-16 个小时）。 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）和几个 50ml 离心管，以备第二天离心收集细菌用。 准备几瓶灭菌水（总量约 1.5 升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌细胞用。 第二天： 取 2-5ml 过夜培养液，接入 500ml LB (或 2XTY)液体培养基中, 控制起始OD600= 0,03-0,05。 37?C，220rpm，振摇2-4 小时，每半小时测一次OD，当OD 值达到 0.4 时，停止培养。 将菌液在冰上预冷 30 分钟。同时，开启离心机，预冷至 4?C。 随后将菌液分装到 250ml 或 500ml 预冷的离心瓶中，4?C，4000rpm 离心 15 分钟。 弃上清液，先用少量（如 20-50ml）灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团，然后加水稀释至离心瓶的 2/3 体积，充分悬起细胞（可以用手握住瓶体上部震荡！）。 4?C，4000rpm 离心 15 分钟。 弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约 500ml 冰水中。4?C，4000rpm，离心 15 分钟。 弃上清，往离心管中加入少量 10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加 10% 甘油至终体积约为 20ml。 4?C, 4000rpm, 离心 10min。 小心弃去上清（沉淀可能会很松散!），加入 2ml 10%甘油(灭菌，预冷)重悬浮细胞。 将悬浮菌液以 200ul/管分装于 1.5ml 的 Ep 离心管中，在液氮中快速冷冻后， 于-70?C 冰箱中保存。 检测转化效率：取 100?l 新鲜制备的感受态细胞，加入 0.01ng 已知浓度的plasmid DNA，电转化后，将重悬在 1ml SOC 培养液并复苏的细胞分别取 10?l (1%)和 100?l (10%)涂板，估测转化效率。 * Optimal efficiency is ca. 1X108 cfu/μg DNA for general cloning. ** For library transformation, efficiency with ca. 1X109 cfu/μg DNA is required. 感受态细胞制备简要流程： 收集细胞?冰水冲洗细胞 2 次?10%甘油冲洗细胞 1 次?重悬细胞在 10%甘油?分装 二、电转化 [连接产物、纯化质粒或质粒文库]： 从-80?C 冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。 将无菌的电击杯置于冰上预冷。 将解冻的感受态细胞按照 40～100ul/管转移至预冷的 1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置。 取1-2 μl 纯化的质粒或克隆连接产物于 1.5ml 的离心管中，冰上放置10min。[加入的 DNA 体积过大时，其中的盐会造成电击时产生电火花！] 打开电转仪[Bio-Rad Gene Pulser System]，调至 Manual，调节参数设置为 25 μF, 200 OHMs, 电压为 2.0 kV [这些参数设置可以根据经验略作调整]。 将此混合物转移至已预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电极杯的底部。用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水。 将电击杯推入电转化仪，按一下 pulse 键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入 2X 500?l 的 SOC 液体培养基，重悬细胞后，转移到 1.5ml 的离心管中。 8．37?C，220－250rpm 复苏 1 小时。 9．离心，涂板，置于 37?C，过夜培养，次日查看转化结果。 三、电击杯的清洗和保存： 1. 用清水将用过的电击杯稍微冲一下，向电击杯中加入 75%酒精冲洗。2．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗 2~3 遍，然后用 1ml 的枪吸取超纯水反复吹打电 击杯 10 次以上。 加入无水乙醇 1-2ml 于电击杯中，浸泡 5 分钟。 弃去无水乙醇，将电击杯倒置于吸水纸上让乙醇充分挥发。 将清洗并干燥好的电击杯加上盖子，存放备用。 LB2 LB 2?TY 200ml g yeast extract g tryptone (or peptone) 2 g NaCl 3.2 g Tryptone 2 g Yeast Extract 1 g NaCl 500ml 2.5 g yeast extract 5 g tryptone (or peptone) 5 g NaCl 8 g Tryptone 5 g Yeast Extract 2.5 g NaCl 1000ml 5 g yeas