大肠杆菌DH5a感受态细胞转化率的改进.pdf

维普资讯 2008年 3月 韶关学院学报 ·自然科学 Mar．2O08 第29卷 第3期 JournalofShao~anUniversity·NaturalScience Vo1．29 No．3 大肠杆菌 DH5a感受态细胞转化率的改进 刘静华，包英华，陈燕飞 (韶关学院英东生物工程学院，广东 韶关 512oo5) 摘要：针对实验材料E．coliDH5a，对该茵株在不同生长时期的转化效率进行测定，确立了一个能制备高转化率感 受态细胞的实验方案．结果表明：在细茵的生长繁殖过程 中，其转化率有很大变化；得到了E．coliDH5a茵株制备 感受态细胞的最佳条件 ． 关键词：大肠杆茵；感受态；转化率 中图分类号：Q78；s855．2 文献标识码：A 文章编号-1007—5348(2oo81o3—0087—04 感受态细胞的制备和转化是分子生物学实验室频繁使用的一项重要的常规操作．对细菌而言，为达到 高效转化，活细胞数务必少于 l0g细胞 ／m1．对于大多数E．coli来说，相当与OD咖为0．4左右．但由于转化是 一 个很复杂的过程，具体的作用机理仍在探究中．有文献指出…，细菌的最佳感受态细胞制备期对于不同菌 株是不同的，并不一定都是在活细胞浓度为 1 细胞 ／ml的时候最适宜，有必要针对所使用的菌株确定其最 佳转化条件． 1材料与方法 1．1 材料与试剂 菌株与质粒：E．coliDH5a，pUCm—T载体 自身环化质粒 DNA来 自鼎国公司．其余试剂为国产分析纯，LB 培养基，氨苄青霉素溶液，0．1mol／LCaCh溶液，均按 《分子克隆实验指南》的要求配制．鼎国公司质粒提取试 剂盒、DNA回收试剂盒． 1．2 实验方法 1．2．1大肠杆菌生长情况的测定： 从平板上挑取单个菌落(直径2～3mm)到含有 3ornlLB培养基的锥形瓶中，37℃下250r／min培养过 夜．取出O．3rnl培养物到含有 l5rnlLB培养基的摇菌试管中，继续振荡培养，每隔 20min取出一支摇菌试 管，放于冰箱．统一测定菌液的OD咖，绘制生长曲线．选取几个不同时相的菌液倍比稀释从 lO～～lO～，各取 0．1ml稀释液涂布 LB平板培养基 ，37℃正向培养 1h后，倒置培养 l2～16h．每个稀释度铺 3个平板 ．计数 ， 作 OD咖一活菌细胞浓度图． 1．2．2 标准质粒制备 抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分析仪下观察 ，将显示为超螺旋 DNA带型的凝胶切下，回收后电 泳确保质粒全部为超螺旋状态，紫外分光光度计测定其浓度及纯度，，IE缓冲液稀释为0．05 ，保存于一 20℃ ． 1．2．3 大肠杆菌感受态细胞制备及转化 37℃下250r／rain培养过夜的大肠杆菌培养物，按 1：40接种于 l5rnlLB培养基的摇菌试管中，继续振荡 收稿 日期：2007—03—06 基金项目：韶关学院教育教学改革研究项 目(NO．SYJYS0702) 作者简介：刘静华 (198o一)，女，广东龙川人，韶关学院英东生物工程学院实验中心助理实验师，主要从事分子生物学、基因工程方面的研究． 维普资讯 · 88 · 韶关学院学报 ·自然科学 2008矩 扩大培养 ．根据生长曲线，每隔一定时间取一支菌液，测定 OD6oo后 1．5ll1l转入 l0ll1l无菌离心管，冰浴中冷 却 10min，4℃，40OOr／rain离心 10min，弃上清，用 1／2体积的预冷0．1mol／LCaCl，溶液悬浮细胞，冰浴中放置 30min，4℃，4OOOr／rain离心 10rnin．根据OD6oo一活菌细胞浓度图，加入一定体积的0．1mol／LCaC12溶液，调 整细胞浓度为2．5×109细胞／ml，取200越感受态细胞，分装到 1．5ll1l无菌离心管，4