实验3 大肠杆菌感受态的制备.ppt

电泳检测PCR扩增产物 电泳检测回收产物 实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2法） 1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 注意事项 实验目的  掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理，学会制备感受态细胞的方法。 实验原理 用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。 实验仪器、材料与试剂 （一）仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 低温离心机 5. 微量取液器 恒温摇床 灭菌锅 （二）材料 大肠杆菌DH 5α。 （三）试剂 1. LB液体培养基 1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl ，pH 7.0 2. 0.1mol/L CaCl2溶液 实验步骤  1. 划线培养，挑取大肠杆菌DH 5α的单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养14h。 2. 取1mL菌液加入100ml LB液体培养基中，扩大培养约2-3h；测OD600值，当OD600约0.4-0.5时，停止培养。 3. 菌液冰上放置10min，无菌条件下移入50ml Beckman离心管中，4℃，4000 rpm，离心10min。 4. 弃上清，在冰浴上加入8ml预冷的无菌CaCl2 (0.1 mol/L)，轻摇或者用移液器轻轻吹吸悬浮细胞；冰上放置5min。 5. 4℃，4000 rpm离心10min。 6. 弃上清，用1.5 ml预冷的无菌CaCl2(0.1 mol/L)重新悬浮细胞，200μL/份分装到预冷的无菌Ep 管中，4℃保存备用。（入15%的甘油，-70℃保存，可保存一年）。 注意事项 感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速。 为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈。 尽量在无菌状态下操作，减少污染的可能。