大肠杆菌感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和重组子筛选.pdf

大肠杆菌感受态细胞的制备、 质粒DNA的转化和重组子筛选 分子生物学实验 牛卫宁 目的要求 1.了解转化的概念及其在分子生物学 研究中的意义。 2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受 态细胞的方法。 3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌 细胞并筛选重组子的方法。 实验原理 转化( Transformation )是将异源DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段， 它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实 验技术。 感受态（Competence) ：细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态 实验原理 受体细胞: E.Coli DH5α：无Ap(Ampicillin)抗性 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系 统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化 酶的突变株。 实验原理 r 外源性质粒: Amp 抗性基因编码一种周质 酶（β- 内酰胺酶）可特异地切割Amp 的β- 内 酰胺环，从而使其失去杀菌能力 实验原理大肠杆菌感受态细胞制备 实验原理 重组子筛选: 抗生素筛选和蓝白斑筛选。蓝白斑筛选时可选用 DH5α 、JM109 等菌株。 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化 合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半 乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整 个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选 的最直观有效的方法。 实验原理 X-GAL 蓝色 实验原理 IPTG 实验原理 载体含有（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。 在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破 坏读码框，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列 的宿主细胞。这样，lacZ基因在宿主细胞与质粒之间实现了互 + 补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ 细菌在诱导剂IPTG 的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。 当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地 导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌 形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。 实验原理  转化方法：电击法、CaCl 等化学试剂法 2  感受态细胞：处理后细胞膜的通透性发 生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过 时细胞的状态。  转化细胞(转化子)：带有异源DNA 分子 的受体细胞( Transformant )。 •大肠杆菌处于00C,CaCl 低渗溶 + 质粒DNA 2 液中,菌细胞膨胀成球形, •外源DNA形成抗DNA酶的羟基- 0 42 C热击， 钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,