猪胰腺脂肪酶基因克隆、毕赤酵母表达及其酶活性检测的中期报告.docx

猪胰腺脂肪酶基因克隆、毕赤酵母表达及其酶活性检测的中期报告 一、研究背景 猪胰腺脂肪酶（POR）是一种广泛分布于动物和植物体内的重要消化酶，能够加速脂肪酯水解为脂肪酸和甘油，对生物体内脂肪的代谢起着重要作用。目前，已经有对不少动物中POR的研究，但是对于猪中POR的研究却较少，因此本研究选择猪胰腺中的POR进行基因克隆、表达和酶活性检测，对于研究猪中POR的分子特性和生物学功能，以及其在制备植物提取物、生产酵素和工业应用等方面都具有一定的意义。 二、实验设计 本实验将采用分子生物学和生物化学的方法，先行对猪中POR进行基因克隆、毕赤酵母表达和纯化，并进一步对其酶活性进行检测，探究POR在猪代谢中的具体作用和生物学意义。 具体实验步骤如下： 1. 提取猪胰腺组织总RNA，通过反转录PCR扩增得到相应的cDNA。 2. 利用生物信息学工具设计猪中POR的全长基因特异性引物，PCR扩增出猪POR cDNA，将其克隆到pMD19-T载体中，进行菌落PCR鉴定和测序。 3. 将猪中POR基因插入到毕赤酵母表达载体pYES2.0中，通过电转化将其转化到毕赤酵母中。 4. 在含有过氧化物酶（POD）的培养基上诱导毕赤酵母进行表达，通过SDS和Western-blotting进行分子量和蛋白表达量的检测。 5. 利用Ni-NTA亲和层析纯化出表达的毕赤酵母猪中POR，检测其纯度以及活性。 6. 在不同的pH和温度条件下检测POR的酶活性。 三、实验进展 1. 因提取猪胰腺RNA时质量不高而影响到PCR扩增效果，故使用了其他组织（如肺、肝）代替进行总RNA提取，成功扩增出了猪中POR的cDNA。 2. 成功将猪中POR基因插入到pYES2.0载体中，并通过电转化转化到毕赤酵母中。 3. 已经成功地得到了猪中POR表达的酵母菌，并发现在含有POD的培养基上，酵母菌表达量较高（约为未添加POD菌株的2倍），并且观察到了明显的特异性表达。 4. 在利用Ni-NTA亲和层析纯化出表达的毕赤酵母猪中POR的过程中，发现纯化效果并不理想，需要进一步优化。 5. 目前正在进行POR的酶活性检测，初步结果表明，POR具有良好的酶活性，并且在不同的pH、温度下酶活性的变化也在进行中。 四、下一步工作 1. 优化纯化过程，提高POR的纯度。 2. 进一步检测POR的酶活性，在不同条件下进行比较，探究其在代谢中的具体作用。 3. 将提纯后的酶用于不同底物的酶促反应实验，并进行动力学参数的测定。 4. 分析猪中POR在脂肪合成和分解过程中的生物学功能。