圆弧青霉碱性脂肪酶基因的克隆、定点突变及其表达的研究的开题报告.docx

圆弧青霉碱性脂肪酶基因的克隆、定点突变及其表达的研究的开题报告 题目：圆弧青霉碱性脂肪酶基因的克隆、定点突变及其表达的研究 一、研究背景及意义： 青霉素是目前世界上主要的抗生素之一，而青霉素合成中的一个重要步骤是，利用青霉素酸环化酶（PCD）催化青霉素酸的环化反应。PCD是一种脂肪酶，属于α/β水解酶超家族中的脂肪酶亚家族。而圆弧菌中的青霉素酸环化酶（PACH）与其他微生物中的PCD相似，但缺乏一个额外的胞内信号肽片段。因此，PACH的特殊结构和表达方式为其在人工合成青霉素工艺上的应用提供了巨大的潜力。本研究通过克隆圆弧青霉碱性脂肪酶基因（PACH）并进行定点突变，以研究其在青霉素合成中的催化作用及其提高催化效率的可能性，有重要的理论意义与应用价值。 二、研究内容及方法： 1. 克隆圆弧青霉碱性脂肪酶基因：根据已有序列设计引物，从圆弧菌中提取基因组DNA，并将其PCR扩增得到目标基因。 2. 定点突变：使用SOE-PCR（spliced overlap extension PCR）方法进行定点突变，设计两对引物在基因中对点突变的位置处引发重叠扩增，并拼接后在大肠杆菌中进行克隆表达。 3. 表达及纯化：将克隆产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，并在IPTG诱导下表达青霉素酸环化酶，将经过裂解和超滤后得到的溶液进行柱层析分离，分离出纯化的重组蛋白。 4. 酶活测定：通过高效液相色谱法（HPLC）检测并测定PACH的酶活。 三、预期结果及意义： 1. 得到圆弧青霉碱性脂肪酶基因，并进行定点突变。 2. 成功表达和纯化青霉素酸环化酶。 3. 测定并分析青霉素酸环化酶的酶活，在探究其催化作用及提高催化效率的同时，为人工合成青霉素的工艺改良提供基础和理论支持。 4. 本研究的结果对于深入了解脂肪酶催化合成作用机制、从基础到应用的研究转化具有重要意义。