黄芩葡萄糖醛酸水解酶基因的克隆、生物信息学分析及表达[权威资料].doc

黄芩葡萄糖醛酸水解酶基因的克隆、生物信息学分析及表达 　　[摘要]该文从黄芩叶中提取总RNA，利用RT-PCR技术克隆了葡萄糖醛酸水解酶基因（sbGUS）的全长（GeneBank登录号KR364726）。该基因全长1584bp，含有1个完整的开放阅读框，编码527个氨基酸，为不稳定亲水蛋白。生物信息学分析结果显示sbGUS编码蛋白分子质量为58.7248kDa，等电点pI5.55，含有信号肽和1个跨膜区，具有1个水解酶超级家族结构域1个未整合的转移糖苷酶催化结构域。二级结构中α-螺旋（Alphahelix）占25.62%，延伸链（extendedstrand）占28.84%，β-转角（Betaturm）占13.28%，无规卷曲（randomcoil）占32.26%。序列比对和系统进化分析表明，sbGUS基因与黄芩（BAA97804.1）核苷酸相似性为98.93%、氨基酸相似性为98.29%，在9个位置氨基酸不同。实时荧光定量PCR检测sbGUS在根中表达丰度最高，其次为花和茎，在叶中表达量最低。这为进一步鉴定sbGUS的功能及开展黄芩素的合成生物学研究奠定基础。 　　[关键词]葡萄糖醛酸水解酶；生物信息学分析；黄芩素；克隆 　　黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabacalensisGeorgi.的干燥根，作为传统中药被广泛使用，其中黄酮类化合物含量较高。许多研究表明黄酮类化合物对人类健康具有很多益处[1]。黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素作为黄芩中主要的黄酮类化合物，具有较好的药理学特性，包括抗过敏、抗炎、保护心脏和大脑、保肝、调节免疫力与抗癌等作用[2-6]。在研究黄芩苷、汉黄芩苷在人体中吸收过程，发现二者最终在肠胃中通过胃肠菌的转化作用形成黄芩素、汉黄芩素等结构被吸收[7]。通过研究发现黄芩素较黄芩苷有更高的生物活性、保健效果更好[8]。目前，关于黄芩苷的生物合成途径研究较多，而就在黄芩中黄芩苷向黄芩素转化研究较少，其中起关键作用的是葡萄糖醛酸水解酶（β-glucuronidase）[9-13]。 　　葡萄糖醛酸水解酶[14]（GUS）是一种糖基水解酶普遍存在于动物、植物和微生物中，主要催化水解来自黏多糖（glycosaminoglycans；GAGs）缩末端的葡萄糖醛酸残基。它被归类为糖基水解酶家族2和家族79，其中家族2葡萄糖醛酸水解酶广泛存在除植物外的生物体中，家族79葡萄糖醛酸水解酶在植物、微生物和脊椎动物中有所报道[15]。尽管β-葡萄糖醛酸酶的存在已被证实在各种植物（无边便帽、黑麦、大黄、水稻、拟南芥、玉米、浮萍、甜菜和烟草）。但是β-葡萄糖醛酸酶的动力学特性和生理角色仍是不清楚。GUS是多基因家族，拟南芥[16]中含有3个AtGUS基因。在黄芩中GUS对黄芩苷具有很高的活性，参与H有效的解毒[14]。 　　黄芩中，sbGUS主要催化黄芩苷水解形成黄芩素，属于糖基水解酶家族79。早在1954年GUS就被Lewy[17]发现当时被命名为黄芩酶，之后在1995年被Matsuda从黄芩中纯化鉴定出来，蛋白质相对分子质量为32kDa，2000年KaoriSasaki[14]从黄芩毛状根中克隆得到完整的GUS基因序列。在植物中关于GUS基因报道比较少，关于GUS基因研究较多的是作为标记基因，1987年Jefferson[18]首先将来自细菌的GUS转入植物，发现其容易检测，具有较高的灵敏度，之后被广泛应用于转基因植物和转基因动物中的标记基因[19]。而在黄芩中由于GUS基因在黄芩素形成方面的特殊性受到人们的关注，黄芩素较黄芩苷有更高的生物活性、保健效果更好，在研究黄芩苷、汉黄芩苷在人体中吸收过程，发现二者最终在肠胃中通过胃肠菌的转化作用形成黄芩素、汉黄芩素等结构被吸收。因此有人试图寻找具有GUS基因的稳定无危害的菌株，通过发酵的方式提高黄芩中黄芩素和汉黄芩素的比例[20]，例如ChenXu[21]利用LactobacillusbrevisRO1中的葡萄糖醛酸酶在含有黄芩根提取物和多种碳源氮源的牛奶中进行发酵，结果黄芩素和汉黄芩素的含量分别提高了3.8，2倍。 　　本文对黄芩中的GUS基因进行了克隆、生物信息学分析及不同部位表达分析，旨在从基因水平上研究黄芩苷转化形成黄芩素的调控机制，实现黄芩素合成基因的高效表达，增加黄芩素成分所占比例。为深入研究GUS家族蛋白的酶学特性和黄酮类生物合成的分子机制提供理论依据。 　　1材料 　　1.1样品黄芩叶，于2014年8月25日，采于吉林农业大学中药材学院药用植物园，由吉林农业大学杨利民、韩梅教授进行物种鉴定。采集后冰袋保存带回实验室，用自来水将叶片表面的泥土冲净，并吸干水分，置于自封袋中-80℃保存备用