CN6 串联质谱法.ppt

二、串联质谱法（MS/MS）鉴定蛋白质技术 1.原理 20种氨基酸根据肽的氨基酸残基不同有多种排列方式20n种，如三肽203种，四肽204种排列方式，出现频率为1/160000 。5-6个氨基酸序列片段可决定蛋白的特异性。 MS/MS可以检测到每一肽段的序列。根据一级质谱测得的精确分子质量和MS/MS所得到的序列信息，结合蛋白质数据库搜索，大大增加了蛋白质鉴定的准确性。 2.影响结果的关键因素 灵敏度、精确度和分辨率 MS/MS图谱质量 3.常用的串联质谱检索工具 SEQUEST F/sequest Mascot PepFrag P ProteinProspector P 4.蛋白质鉴定的结果评价 在数据库中可以查到蛋白质的全序列，以及质谱检测肽段的覆盖率。覆盖率越高表明检索结果越可靠。一般覆盖率为20～50%。 查询到蛋白质全序列后，应根据其精确分子量和等电点，与蛋白质在双向电泳图谱中的位置进行对比，进一步确证鉴定结果。 影响蛋白质覆盖率的因素： 1.蛋白质酶解效率和酶解肽段的获得率 2.蛋白质被修饰情况 3.蛋白质很微量或杂质多，质谱分析信噪比低 二级质谱图 ? 在一级质谱图中，选择其中的一个峰，对其进行CID过程，就得到一张二级质谱图。 ? 这里的假设是一级质谱中的一个峰就对应了一个多肽，实际情况可能并不是这样。 ? 先看一张二级质谱图，然后我们来解释CID过程。 典型二级质谱图 CID CID，即Collision-induced Dissociation，是通过撞击使得多肽的肽键断裂的过程。 ? 在做二级质谱的试验时，质谱仪选择一级质谱中的一个峰，也就是对应质荷比的这些离子，让这些离子高速撞击质谱仪中的惰性气体，使其肽键断裂，这就是CID。 串联质谱仪可获得肽段序列信息。肽段母离子在质谱仪的碰撞室经高流速惰性气体碰撞解离，沿肽链在酰氨键处断裂并形成子离子。肽键断裂时，会产生a、b、c型和x、y、z型离子， a、b、c型离子保留肽链N端，电荷留在离子C端， x、y、z型离子保留肽链C端，电荷留在离子N端。其中在羰基和酰胺氮之间键的裂解形成b离子（带NH2端的片段）和y离子（COOH端的片段）在质谱图中较多见，丰度较高。y、b系列相临离子的质量差，即为氨基酸残基质量，根据完整或互补的y、b系列离子可推算出氨基酸的序列。 肽键及其断裂 肽键断裂的说明 ? CID中，肽键的断裂方式有非常多的可能性。关于具体的断裂方式，可以去查询生物化学方面的书籍。 ? 通常，我们只考虑b系列和y系列。原因是我们使用的电压较低，其他系列的离子不易产生。 一些常见的特殊情况 ? 除了普通的肽键断裂以外，还经常有一些特殊的情况。 ? 某些酸性氨基酸可能会在CID中丢失一个水分子（H2O），而碱性氨基酸会在CID中丢失一个氨分子（NH3）。 ? 翻译后修饰：有时，二级质谱中需要考虑某些氨基酸可能被修饰（磷酸化、糖基化等），这些修饰可能改变残基的分子量。 ? 给定肽的串联质谱，首先从数据库中选出与其母肽质量相匹配的那些肽（作为后选肽），然后把给定的质谱与数据库中的后选肽的理论质谱相比较，最后，将这些后选肽按照它们的质谱与给定的质谱的匹配程度进行打分排序。 用串联质谱数据搜索数据库 适于识别复杂的蛋白质混合物；验证肽质量指纹搜索的结果。 数据库处理模块依次从指定数据库读出每条蛋白质记录。根据酶、遗漏切点等数据模拟水解这个蛋白质，生成所有可能的理论肽。从这些理论肽可以计算出理论MS。根据实验参数和肽的物理化学性质对每个理论肽可以进行模拟碎裂过程，生成理论碎片离子。从这些理论碎片离子可以计算出每个肽对应的理论MS/MS. 在理论MS/MS和实验MS/MS比较打分之前，需要对实验质谱信息进行预处理和解释。过滤掉不满足要求的蛋白质序列或肽序列。 预处理是为了去除实验质谱中的噪声，提取有效数据。 对质谱的解释可以得到序列标签等信息。（由CID图谱还可获得的几个序列的残基，叫做“肽序列标签” ） 最后将理论MS/MS与实验MS/MS进行比较，给肽和蛋白质打分。得到的结果按分值排列，高通量的系统还应对分值的有效性进行评价。 缺点：要依赖一个蛋白质数据库以及该数据库中蛋白质条目的正确性；普遍存在的翻译后修饰会降低肽鉴定的精度；随着数据库中蛋白质序列的增长，数据库搜索的鉴定方法会越来越慢；这种方法不会发现新蛋白质。 当我们拥有近乎完美的二级质谱图时，我们可以采用这种De-novo Sequencing的办法，即根据质谱碎片图用软件推导。 但是，实际情况