牛奶中青霉素的测定 液相色谱-串联质谱法 .docx
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牛奶中青霉素族抗生素的测定液相色谱-串联质谱法
1范围
本文件规定了牛奶中青霉素族抗生素（阿莫西林、氨苄西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、双氯西林）的液相色谱-串联质谱检测方法。
本文件适用牛奶中9种青霉素的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样经70%的乙腈水溶液超声提取，QuEChERS法净化后，经反相色谱柱分离，供液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。
5试剂和材料
本方法所用的试剂，除另有规定外，均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1乙腈：色谱纯。5.1.2甲酸：优级纯。
5.1.3十八烷基（C18）粉末：粒径40μm~60μm。
5.1.4N-丙基乙二胺（PSA）粉末：粒径40μm~60μm。
5.1.50.2%甲酸溶液：取0.2mL甲酸（5.1.2），用水定容到100mL，摇匀。
5.1.60.2%甲酸乙腈溶液：取0.2mL甲酸（5.1.2）用乙腈（5.1.1）定容到100mL，摇匀。5.1.770%乙腈溶液：取70mL乙腈（5.1.1），用水定容到100mL，摇匀。
5.1.820%乙腈溶液：取20mL乙腈（5.1.1），用水定容到100mL，摇匀。
5.2标准品
9种青霉素标准品名称、化学分子式和CAS号见附录表A。
5.3标准溶液配制
T/NAIAXXX—2025
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5.3.1标准储备液（1.0mg/mL）：分别准确称取9种青霉素标准物质适量，用水溶解并定容至10.0mL容量瓶中，避光冷藏贮存，保存期限为3个月。
5.3.2混合标准储备液：分别移取青霉素G和奈夫西林标准储备液适量，混合后用水逐级稀释得到1.0μg/mL的混合标准储备液I;将其余7种青霉素用同样的方式进行稀释，得到1.0μg/mL的混合标准储备溶液II，避光冷藏贮存，保存期限为1个月。
5.3.3标准工作溶液：分别准确吸取不同体积混合标准储备液I和II，用空白牛奶基质定容至1.0mL，配制成青霉素G和奈夫西林的浓度分别为0.4、1.0、2.0、5.0、10.0ng/mL，其余7种青霉素的浓度分别为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0ng/mL的系列标准工作溶液，临用现配。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源。
6.2天平：感量0.00001g和0.01g。6.3涡旋混合器。
6.4高速离心机：最大转速8000r/min。
6.5超声波清洗器。6.6氮吹仪。
6.7有机微孔滤膜，孔径0.22μm，或相当者。
7分析步骤
7.1试样制备
取适量样品混合均匀，密封置4℃下保存。
7.2试液的提取
称取试样2.0g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入70%乙腈溶液（5.1.7）10mL，涡旋混合1min，超声5min，8000r/min离心5min，取上清液，残渣加70%乙腈溶液（5.1.7）10mL重复提取一次，合并上清液，用70%乙腈溶液（5.1.7）稀释至25.0mL。精密吸取5mL上清液，置于预先装有150mgC18（5.1.3）、100mgPSA（5.1.4）的离心管中，涡旋2min，8000r/min离心5min，取上清液于45℃水浴中氮气吹干，精密加入20%乙腈溶液（5.1.8）1.0mL，涡旋混匀，有机滤膜过滤后，上机测定。
7.3仪器参考条件
7.3.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：C18，2.1mm×150mm，粒径3.5μm或性能相当。
b）柱温：30℃。
c）流动相：A：0.2%的甲酸溶液（5.1.5），B：0.2%甲酸乙腈溶液（5.1.6）；梯度洗脱见表1。
d）流速：0.3mL/min。e）进样量：5μL。
T/NAIAXXX—2025
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表1流动相及梯度洗脱条件
时间/min
流速/（mL/min）
流动相A/%
流动相B/%
0.00
0.3
95
5
3.00
0.3
95
5
3.01
0.3
50
50
13.00
0.3
50
95
13.01
0.3
95
5
15.00
0.3
95
5
7.3.2质谱参