外周血单个核细胞分离实验.pptx
外周血单个核细胞分离实验
演讲人：
日期:
目录
02
材料准备
01
实验原理
03
操作流程
04
质量控制
05
结果分析
06
应用场景
01
实验原理
密度梯度离心法机制
离心原理
离心过程
密度梯度介质
根据不同物质在离心场中的沉降速度不同，将样品中的各个组分分离开来。
常用的密度梯度介质有聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll）和聚蔗糖-泛影酸钠（Percoll）等，这些介质在离心过程中能形成一个连续或不连续的密度梯度。
将充分混匀的样品和密度梯度介质混合物置于离心管中，进行一定时间的离心，由于各组分密度不同，在离心力的作用下，不同组分会在介质中分层，从而实现分离。
PBMC组成与分布特征
外周血单个核细胞（PBMC）主要由淋巴细胞和单核细胞组成，其中淋巴细胞约占70%-90%，单核细胞约占10%-30%。
PBMC组成
细胞分布
细胞特征
PBMC在外周血中分布不均匀，其数量和比例受多种因素影响，如年龄、性别、健康状况等。
淋巴细胞具有免疫功能，能够识别和清除体内异物，单核细胞则具有吞噬和消化功能，能够吞噬和清除衰老的细胞和细胞碎片。
分离实验的临床意义
免疫学研究
PBMC是免疫学研究中的重要材料，可用于研究机体的免疫功能、免疫应答和免疫调节等。
疾病诊断与治疗
细胞治疗
PBMC的分离和检测对于某些疾病的诊断和治疗具有重要意义，如自身免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等。
PBMC可用于细胞治疗，如过继性细胞免疫治疗、细胞因子疗法等，为某些疾病的治疗提供了新的手段和方法。
1
2
3
02
材料准备
抗凝剂与分离液选择
01
抗凝剂
采用肝素或EDTA等抗凝剂，以防止血液凝固。
02
分离液
常用的分离液有Ficoll、Percoll等，应根据实验需求选择合适密度和黏度的分离液。
无菌耗材清单一览
无菌试管，用于混合抗凝剂和血液。
试管
无菌移液器，用于精确吸取和分配各种液体。
移液器
无菌离心管，用于离心分离单个核细胞。
离心管
无菌过滤器，用于过滤去除杂质和细胞团块。
过滤器
离心设备参数配置
温度
离心过程中需保持恒定温度，通常在室温下进行，避免温度过高或过低对细胞造成影响。
03
离心时间通常设定为10-30分钟，根据细胞悬液的浓度和分离效果进行调整。
02
离心时间
离心速度
根据分离液和细胞的特点，设定适当的离心速度，通常为1000-3000rpm。
01
03
操作流程
血液样本预处理步骤
使用肝素或EDTA等抗凝剂处理血液，防止血液凝固。
抗凝处理
稀释血液
过滤
用等渗盐水或特定稀释液将血液稀释，降低细胞密度，有利于后续操作。
去除血液中的杂质和细胞团块，防止堵塞离心管或造成细胞损伤。
梯度离心分层控制
选择合适的离心管
根据所需分离的细胞类型和数量，选择适当大小和材质的离心管。
01
制备梯度
将不同密度的分离液小心地依次加入离心管中，以形成连续的梯度。
02
离心操作
将血液样本轻轻地加在梯度上方，然后进行离心，使细胞根据密度分层。
03
离心后，在离心管中可以看到不同密度的液体之间形成的界面层，其中富含目标细胞。
界面细胞层吸取技巧
识别界面层
用吸管或移液器小心地吸取界面层的细胞，避免吸取到其他层的细胞或杂质。
小心吸取
将吸取的细胞转移到新的离心管中，用等渗盐水或特定洗涤液洗涤细胞，去除残留的分离液和杂质。
洗涤细胞
04
质量控制
细胞活性检测方法
通过活细胞不吸收台盼蓝的特性来判定细胞活性，具有简便、快速、重复性好的优点。
台盼蓝染色法
利用荧光染料CFDASE标记细胞，通过流式细胞术检测细胞活性，具有灵敏度高、结果准确的优点。
CFDASE标记法
01
02
纯度评估标准体系
通过显微镜观察细胞的形态学特征，如大小、形态、核浆比例等，初步评估细胞纯度。
细胞形态学检测
利用流式细胞术、免疫荧光等技术检测细胞表面特异性标志物，以评估细胞纯度。
细胞表面标志物检测
通过检测细胞的增殖、分化、分泌等功能，评估细胞纯度及功能状态。
细胞功能检测
污染风险防控要点
实验环境洁净
实验器材灭菌
实验操作规范
样本处理规范
实验室需进行严格的消毒和洁净处理，实验过程中需保持无菌操作。
实验前需对实验器材进行高温高压灭菌处理，以降低污染风险。
实验过程中需严格按照操作规程进行，避免交叉污染。
样本采集、处理和储存过程中需严格控制污染风险，确保样本的完整性和纯净性。
05
结果分析
典型显微镜观察特征
细胞形态
单个核细胞在显微镜下呈现圆形或椭圆形，核较大，胞质较少，常呈现透明或嗜碱性。
01
细胞结构
可观察到细胞的核仁、核膜及胞质内的颗粒。
02
染色特征
使用特定染色方法，单个核细胞可被染成特定的颜色，便于观察和识别。
03
流式细胞术验证方案
样本制备
荧光标记
仪器设定
数据分析
将分离得到