3.第三章 基因工程载体.ppt

DNA重组技术的基本工具;;;;;;;;;;;;;3. 质粒的基本特性 质粒的自主复制性 质粒的不相容性 质粒的可转移性 携带特殊的遗传标记;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;噬菌体的生活周期 溶菌周期：烈性噬菌体（virulent phage) 感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。 2. 溶源周期：温和噬菌体（temperate phage) 感染细菌后，将自己的DNA整合到 细菌的染色体DNA中，成为它的一个组成部分。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;表达载体的类型 质粒表达载体 病毒表达载体 大片段表达载体 分类： 根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表达载体（胞内表达载体）和分泌型表达载体； 根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达载体和真核细胞表达载体； ;（一）原核表达载体 真核基因在原核细胞中表达，载体必须具备的条件： ⑴ 具有复制起点，载体能够独立复制 。 ⑵ 应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。 ⑶ 应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。 ⑷ 应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。 ⑸应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。 ⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。;;;表达形式 单一型表达：单一基因的编码区，表达完整单一蛋白。 融合型表达：多个基因的编码区的串联体，表达出融合蛋白(fusion protein)。 融合标签蛋白：有利于蛋白纯化和检测； 融合多个目标蛋白：则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。;表达形式 组成型表达：在组成型启动子（如：T7噬菌体启动子）的驱动下即可源源不断的表达外源基因。 适合对宿主细胞无毒的蛋白表达。 诱导型表达：在诱导型启动子和特定环境信号刺激下，外源基因的表达开放或增强。 适合有毒蛋白表达，无毒蛋白表达也可。 ;表达融合蛋白的表达载体 6 ×His（组氨酸）标签表达载体：pET系列，可在目标蛋白的N-端或C-端加上6个组氨酸的标签，能与镍等二价金属离子结合，纯化目的蛋白。 GST (glutahione S-transferase, 谷胱苷肽S-转移酶)表达载体：pGEX系列，融合蛋白纯化出来后用凝血蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。 ;;;;;;;;;;;;;;RNAi----- RNA interference (RNA干扰) siRNA-----Small interfering RNA (小干扰性RNA) dsRNA------double strand RNA (双链RNA) RISC------RNA-induced silencing complex (RNA诱导沉默复合物) Dicer------ RNAase III—related enzymes (RNAase III家族成员) PTGS------Post-transcriptional gene silencing (转录后基因沉默);; 确定目的基因  根据相对应的核酸序列设计出 siRNA的序列  获得siRNA  用siRNA转染细胞  分析RNA干扰的效果;;;;;1.质粒是基因工程最常用的运载体，它的主要特点是( )? ①能自主复制?②不能自主复制?③结构很小?④蛋白质?⑤环状RNA?⑥环状DNA?⑦能“友好”地“借居”? A．①③⑤⑦????B．②④⑥????C．①③⑥⑦???D．②③⑥⑦? 2．基因工程中常作为基因的运载体的一组是( )? A．质粒、线粒体、噬菌体????B．染色体、叶绿体、线粒体? C．质粒、噬菌体、动植物病毒???D．细菌、噬菌体、动植物病毒 3、下面分子克隆载体中，能承载外源基因最多的载体是（ ） A、质粒载体； B、λ噬菌体载体； C、柯斯质粒载体 D、BAC载体;4. pBR322质粒作为基因克隆载体具有下列何种调控元件（ ） A.AmPr和Tetr B.ori复制子 C.LacZ标记 D.多克隆位点 ? 5. λ噬菌体体外包装目的基因片段的大小应为 （ ） A.小于λ噬菌体DNA的