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第三章 基因工程载体 基因克隆载体 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。 基因克隆载体(DNA克隆载体)：通过不同途径能将承载的外源DNA片段(基因)带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。 载体的功能及特征 一、发展概况 1.??第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2.??第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 载体应具备的条件 在克隆载体DNA分子合适的位置有一至多个克隆位点，供外源DNA片段组入克隆载体DNA分子。 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 克隆载体必须是安全的。 第一节 质粒克隆载体 一、 质粒的一般生物学特性 发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母 独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。 比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。 一、质粒的一般生物学特性 质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子 在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共价闭合环DNA分子（ccc-DNA）的形式存在。 在体外理化因子作用下，质粒可以成为开环DNA分子（oc-DNA）或线形DNA分子（l-DNA）。 在变性条件下，质粒可成为单链DNA分子（ss-DNA）。 质粒DNA分子大小1-100Kb以上。 质粒DNA的复制 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 复制方向性：纯单向性（ColEI）；纯双向性（F质粒）；既有单向又有双向性（R6K）。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 – 数个 拷贝 stringent plasmid 松弛型复制控制的质粒 10 个 拷贝以上 stringent plasmid 质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制引物与模板的结合 质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合 质粒的不亲和性 有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 质粒迁移 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义 质粒载体 二、构建质粒克隆载体的基本策略 1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝。 2、含有尽可能多的克隆位点。 3、含有供选择克隆子的标记基因。 4、构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。 5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。 三、质粒克隆载体的构建 质粒克隆载体的设计和构建过程的原则 选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 正确获得构建质粒克隆载体的元件。 组装合适的选择标记基因。 选用合适的启动子。 在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构建过程力求简单。 大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生质粒克隆载体的构建 pBR322的构建是质粒载体构建