第三章基因工程的载体讲课.ppt

（一）质粒的生物学特性 ⑹ 质粒的转移???????????? ???????????????????????? （二）质粒DNA的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。 （三）质粒载体的改造 ⑴去掉不必要的DNA区段。 ⑵减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。 ⑶加入易于捡出的选择性标记基因。 ⑷对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便 转移。 ⑸改造或增加基因表达的调控序列。 1、质粒pBR322 pBR322质粒的优点： （1）具有较小的分子量。 4363bp，2.6×106Da， （2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 （3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。 （4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。 外源DNA 2、pUC质粒载体 1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的 结构： （1）来自于pBR322的Ori （2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列发生了变化 （3） LacZ′基因 编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。 （4）MCS区段 2、pUC质粒载体 与pBR322相比， pUC质粒载体优点： （1）具有更小的分子量和更高的拷贝数 如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500～700个拷贝 （2）适用于组织化学法检测重组体 通过?-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。 （3）具有多克隆位点区段（MCS） 可以定向克隆防止载体自我连接。 2. ?噬菌体的生物学特性 ⑵是一个温和噬菌体 一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。 ⑶复制 溶源周期随溶源细菌染色体一起复制 溶菌周期的早期是“θ”复制，晚期进行滚环复制 ⑷基因组成 ?DNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3为非必须区段。 * 第二章 基因工程的载体和工具酶 第一节 载体 引 言 基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。 作为基因克隆的载体必须具备以下特性： ⑴载体必须是复制子。 ⑵具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。 ⑶具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。 ⑷自身分子量较小，拷贝数高。 ⑸在宿主细胞内稳定性高。 一、 质粒载体 （plasimid vectors） （一）质粒载体的生物学特性 （二）质粒载体的制备 （三）质粒载体的改造 （一）质粒的生物学特性 （1）质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状(少数为线形和RNA） DNA分子。 广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒主要有F质粒（F因子）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（大肠杆菌素因子）三种。 （一）质粒的生物学特性 （2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。 （3）质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。 （一）质粒的生物学特性 （4）质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）,拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）,拷贝数为10-60。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。 （5）质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。 接合型质粒 分子量大 严紧型复制? 非接合型质粒 分子量小 松弛型复制? 是否含有接合转移基因? 非转移性质粒，不含tra基因；可以为转移性质粒所带动转移。 转移性质粒，含有tra基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。 在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关性。现归纳如下： （一）质粒的