3.第三章 基因工程载体.ppt

表达形式 单一型表达：单一基因的编码区，表达完整单一蛋白。 融合型表达：多个基因的编码区的串联体，表达出融合蛋白(fusion protein)。 融合标签蛋白：有利于蛋白纯化和检测； 融合多个目标蛋白：则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。 一、质粒表达载体 表达形式 组成型表达：在组成型启动子（如：T7噬菌体启动子）的驱动下即可源源不断的表达外源基因。 适合对宿主细胞无毒的蛋白表达。 诱导型表达：在诱导型启动子和特定环境信号刺激下，外源基因的表达开放或增强。 适合有毒蛋白表达，无毒蛋白表达也可。 一、质粒表达载体 表达融合蛋白的表达载体 6 ×His（组氨酸）标签表达载体：pET系列，可在目标蛋白的N-端或C-端加上6个组氨酸的标签，能与镍等二价金属离子结合，纯化目的蛋白。 GST (glutahione S-transferase, 谷胱苷肽S-转移酶)表达载体：pGEX系列，融合蛋白纯化出来后用凝血蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。 一、质粒表达载体 一、质粒表达载体 (二)酵母表达载体——真核表达的首选系统 原核生物和真核生物存在翻译后修饰反应机制的差异， 真核基因在原核表达系统中难以获得有活性的蛋白。 酵母表达载体是一种穿梭表达载体：既能在大肠杆菌中繁殖，又能在酵母中复制、表达。 Yeast复制起点 E.coli复制起点 E.coli选择标记 Yeast选择标记 MCS A、删除不必要的DNA区域: 尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。 B、减少限制性酶切点: 缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接酶的共同作用，机械破碎和质粒之间的重组等方法。 C、加入易于识别的选择标记：通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。 D、安全性能改造：质粒载体不能在细菌之间随便转移。 E、改造或加入基因表达的调控序列：启动子。 质粒的改造 一、 质粒载体 6.常用质粒载体 复制起点? 遗传标记基因 克隆位点 克隆位点 在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。 TC r （1） pBR322 一、 质粒载体 含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。 含有大肠杆菌? -半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码? -肽链的DNA序列，即lacZ’基因。 在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS区段，但并不破坏该基因的功能。 　 （2） pUC系列质粒载体 　在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体(转化载体后，阳性克隆在有选择压力的培养基上能正常生长)，其组成如下： 无质粒的 受体菌 ?-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；无抗菌素抗性 在含抗菌素和Xgal的培养基上培养 质粒pUC转化的受体菌 ?-半乳糖苷酶的缺失被载体产物?互补，能分解Xgal。且有抗菌素抗性 在含抗菌素和Xgal的培养基上培养 pUC+外源DNA插入的质粒转化的受体菌 载体产物失活，不能互补?-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性 在含抗菌素和Xgal的培养基上培养 ? ? ? 无菌斑生长 有蓝色菌斑生长 有白色菌斑生长 一、 质粒载体 （3）穿梭质粒载体(shuttle vector) ： 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 大肠杆菌?枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌?酿酒酵母穿梭载体 大肠杆菌?动物细胞穿梭载体 Yeast复制起点 E.coli复制起点 E.coli选择标记 Yeast选择标记 MCS 一、质粒载体 TA克隆载体——PCR产物克隆载体 用Taq酶的PCR产物3’端加上了一个A。根据这一特点研制出一种线性质粒，其5’端突出的T，可与Taq酶的PCR产物间连接，即TA克隆。 构建方法： 如：pMD18-T，pGEM-T 载体的线性化 载体末端补平 载体末端加T 二、噬菌体载体 　　　噬菌体（Bacteriophage）它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA(线性)，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。 二、噬菌体载体 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。 能被开发成为基因工程的有用载体的原因： 1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。 噬菌体的生活周期