基因工程课件-第三章 基因的体外重组.pptx

（1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。; 基因工程中常用的载体有5类： ;（1）质粒（plasmid）载体 ;大肠杆菌的质粒;分子大小：1—200kb b. 编码基因：2—3个中等大小的蛋白质。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。 c. 形状：双链环状DNA。;开环DNA（ocDNA）OC构型； 线形DNA （lDNA），L构型。;③质粒的类型;大肠杆菌接合（conjunction）;b. 非接合型质粒：;根据质粒在寄主细胞内存在的拷贝数的多少，分为两类：;分子量大，拷贝数低。; i) 具有复制起点(ORI)：这是自我增值必不可少的元件。 ii) 具有抗菌素抗性基因：这是筛选的标志。 iii) 具有若干限制性内切酶的单一识别位点：用来插入外源DNA片断，且插入后不影响复制功能。;通常是：氨苄青霉素抗性（Ampr）、卡那霉素抗性（Kanr）、四环素抗性（Tetr）、链霉素抗性（Strr）、氯霉素抗性（Cmlr）等。;⑥人工构建的质粒载体的类型;ii)低拷贝数的质粒载体;iii)失控的质粒载体;iv)正选择的质粒载体;;;;;V) 表达型质粒载体;;⑦经典的大肠杆菌质粒载体;;ii) ColE1：;;长度：4363bp。 有24个克隆位点，其中9个会导致Tetr基因失活，3个会导致Ampr基因失活。 优点：是分子小、双抗菌素抗性选择标记、高拷贝数。;;PBR322的改进;iv) pUC系列;;;pET表达系统;⑧质粒载体的不稳定性;质粒分配方式;在寄主菌的细胞分离的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。;不同类型的质粒在菌体中的拷贝数不完全相同。;（2）噬菌体载体 ;;温和噬菌体（temperate phage)感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中，形成原噬菌体（prophage)，这一过程称为溶源化（lysogenization)。;;Iii）单链噬菌体载体——M13噬菌体;;M13的多克隆位点;iv) 双链噬菌体载体—?载体;?载体克隆策略;外源基因插入? DNA象质粒载体那样直接转化（transfection）细菌时，效率远比质粒低。; ;E基因突变;?噬菌体头部蛋白质外壳容纳DNA的能力是有限度的。必须在正常野生型容量的75%—105%(36—51kb）之间： 既不能超过正常野生型容量的5%； 又不能低于正常野生型容量的75%;1978年J. Collins和B. Hohn等人发展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid)(带有粘性末端cos位点的质粒）。;;具有?噬菌体的特性：克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒病有效地感染细菌，在寄主细胞内形成环化DNA，但不能溶菌，不能形成新的噬菌体颗粒。;用于大分子DNA的克隆。100kp 1983年形成基础理论（A.W.Murray）, D.T.Burke等1987年变为现实。;着丝粒区（CEN）;;;H.Shizuya等1992年在大肠杆菌F因子的基础上构建的。;;二、限制性核酸内切酶;修饰： 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。;R/M system; 如EcoB和EcoK。 首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。;②切割位点;首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个是Hind Ⅱ。;EcoR I 5’-G?AATTC-3’ 3’-CTTAA?G-5’ Pst I 5’-CTGCA?G-3’ 3’-G?ACGTA-5’ 产生粘性末端;③粘性末端：; a. 一条DNA双链粘性末端的凸出部分的几个单链核苷酸可以与另一条DNA双链的粘性末端以碱基互补配对的方式复性连接起来（分子间连接），这比连接两个平齐末端容易的多。 同一个DNA分子通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子（分子内连接）。;;c. 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。;识别位点的序列相同的限制性内切酶。;完全同裂酶;识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等。 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能在被原来的同尾酶识别。 ;;限制性内切酶的识别和酶切活性一般是在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。;;（3）III类限制性内切酶 ;核酸限制性内切酶的类型及主要特性;切割位点;1973年H.O S