神经珠蛋白基因在毕赤酵母中的表达研究.pdf

发酵工程学科的进展 ——第四次空国发酵工程学术讨论畲话文集 神经珠蛋白基因在毕赤酵母中的表达 廖祥儒，张峰，张建国。赵慧 (扛南大学生物工程学院，无锡214036) 摘要：根据GenBank的神经珠蛋白的基园序列设计了针对于真核表达载体pPIC9K的引 物Pe，以从中国人胎脑中提取的总RNA为模板，利用RT—PCR技束获得了编码神经珠蛋 白的基固序列，构建了毕赤酵母寰迭质牲，并转化了毕赤酵母。结果表明，NGB基因的真核 表连载体已经成功的和甲醇酵母染色体整寺．对重组菌株进行诱导，经sDs—PAGE电泳 鉴定．初步认为外浑蛋自在宿主曹得到了表达． 关键词：神经珠蛋白}基因克隆}表达f毕赤酵母 要表达于脊椎动物的脑中，与脑内供氧密切相关。神经珠蛋白具有高的氧的亲和力，并 且能和氧可逆性的结合，半饱和氧分压大于血红蛋白小于肌红蛋白[”，即使在血氧浓度 较低的情况下，与氧有很高亲和力的NGB，十分有利于转运氧通过血脑屏障，提高脑组织 中氧的利用率口】。目前认为，神经珠蛋白作为氧的携带者，能够促进氧气扩散进入线粒 体的能力，提高氧的利用率，从而满足神经细胞活跃的需氧代谢D]。已证实低氧诱导 NGB表达可减少神经细胞的损伤，抑制NGB表达可增加神经细胞的损伤，而过表达 NGB能增强细胞的低氧耐受能力“】。NGB能够增强低氧情况下神经细胞的存活能力， 具有明显的保护神经细胞的功能o]。体外试验表明，NGB是脑病理性缺血的内在神经保 护因子o]。根据亚铁血红紊蛋白家族的功能相似性推测，神经珠蛋白可以清除细胞内 NO和02或者作为NO、O。等气体配体的氧感受子，通过低氧信号转导途径调节下游基 因的表达，从而使细胞适应氧浓度的变化…。 老年痴呆症和脑卒中严重威胁老年人的健康，其发病分别与脑衰老、损伤引起的脑 缺氧有关。因此，利用生物工程生产NGB并应用对预防和治疗老年痴呆症、脑卒中至关 重要。本实验利用基因工程的方法对中国人神经珠蛋白基因进行克隆表达，为获得大 量、低成本、高活性的NGB基因工程药物的开发奠定基础。 1材料与方法： 1．1实验材料 中国人胎儿脑组织(无菌条件下，取自某医院因车祸死亡的母婴胎儿)，冻存于一 70℃冰箱中。 1．2质粒与菌株 18一T D504A) vector质粒(Code pPIC9k质粒，甲醇酵母(Pichiapastoris)。pMD 第四次全国发酵工程学术讨论会 (购自日本TaKaRa公司)。大肠杆菌JMl09菌株(本实验室保存)。 1．3 NGB基因扩增 5．0软件 设计。在正向引物5’端加EcoR I酶切位点及保护碱基g，在反向引物5’端加NotI酶 切位点及保护碱基ataagaat。引物Pe的核苷酸序列如下： attcat eve 正向引物(PF—e)：5’一ggaggagcg ggagc一3’ agaatgegg cttact eatecc 反向引物(PR—e)：5’一ata ecg egc ag一3’ 利用异硫氰酸胍——酚／氯仿一步法提取人胎脑组织总RNA[”，利用设计的引物经 GelDNAPurifica- RT—PCR法扩增中国人神经珠蛋白基因片段，用TaKaRaAgarose tionKit Ver．2．0试剂盒回收NGB基因片段。 1．4中国人神经珠蛋白真核基因表达载体的构建 基中，30℃培养过夜。以SDS一步法o“1提取酵母染色体DNA