神经营养素3基因的人工合成及其在毕赤酵母中的分泌性表达研究.pdf

神经营养素一3基因的人工合成及其在毕赤酵母中的分泌性表达 摘 要 根据人神经营养素一3(Humanneurotrohin-3,hNT-3)的基因序列，把编码 氨基酸的密码子转换成毕赤酵母 (Pichiapastoris)偏爱的形式，设计了10条 36bp-59bp的寡聚核营酸引物，通过5次连续PCR反应，获得了人工合成的N丁一3 cDNA片段 (简称NT-3b基因)。将合成的NT-36基因克隆到pPIC9K质粒上， 获得重组表达载体pPIC9K-NT-3b。将重组表达载体pPIC9K-NT-3b和 pPIC9K-hNT-3用Sal工酶切线化，通过电击转化法转化宿主毕赤酵母GS115菌 株，获得的转化子在含有不同浓度的抗生素G418(lmg/mL,2mg/mL,3mg/mL) 的YPD平板上筛选，2个基因分别取18个重组转化子在BMMY培养基中诱导 培养 5天，每天添加 0.5%甲醇并取样。表达产物进行SDS电泳检测、 Westernblot检测和ELISA分析，结果表明，NT-3b基因和hNT-3基因成功获得 分泌性表达，从整体水平上，使用偏爱密码子的NT-3b基因在毕赤酵母GS115 株中的表达明显优越于hNT-3基因(t=2.8361,P0.01)，表达量在诱导后72h-96h 最高，达到31mg/L左右。hNT-3基因和NT-3b基因的表达产物均具有NT-3抗 体的免疫学活性。 关键词:神经营养素一3，毕赤酵母，偏爱密码子，基因合成，分泌性表达 神经营养素-3基因的人工合成及其在毕赤醉母中的分泌性表达 Abstract ZhangChaochun(Microbiology) DirectedbyProf.XicaiYang A357bpDNAfragmentencodingHumanneurotrohin-3(hNT-3)wasdesignedbased onthenucleotidesequenceofhNT-3andtheoptimalcodonusageofPichiapastoriso Thegene(calledNT-3bgene) wasassembledthroughfiveroundsofPCRfromatotal ofonlyten36bp-59bpoligoes. TheNT-3bgenewasclonedintothevectorpPIC9Kto constructarecombinantvectorpPIC9K-NT-3b.Thisvectorandanotherrecombinant vectorpPIC9K-NT-3,whichincludedhNT-3gene,werelinearizedwithSalIand transformedintotheGS115yeaststrainrespectivelybytheelectroporationtoobtain transformants.ThetransformantswerescreenedontheYPD-G418platescontaining G418atdifferentfinalconcentration(Img/mL,2mg/mL,3mg/mL).18transformants ofeachgenewereinducedbymethanolinBMMYfor5days.Theexpressionproduct wasanalyzedbySDS,WesternblotandELISA.Theresultsshowedthat solubleNT-3weresecretedintoculturesupernatant.TheNT-3bgeneisbetterthanthe hNT-3geneforexpressionintheGS115yeaststrain(t=2.8361,P0.01)andthe expressionlevelwashigherbetween72h-96hafterinducted,reachingabout31mg/L Theexpressionproductsofthebothgenesshowedsatifatoryan