毕赤酵母分泌表达JEVprME蛋白和其形成病毒样.PDF

生 物 工 程 学 报 赵鹏 等/毕赤酵母分泌表达JEV prME 蛋白及其形成病毒样颗粒的免疫原性鉴定 863 Chinese Journal of Biotechnology /cjbcn May 25, 2017, 33(5): 863−874 DOI: 10.13345/j.cjb.170026 ©2017 Chin J Biotech, All rights reserved ·生物技术与方法· JEV prME 赵鹏，江雅，王经满，范浩杰，曹瑞兵 210095 , , , . JEV prME . , 2017, 33(5): 863–874. Zhao P, Jiang Y, Wang JM, et al. Secreted expression of Japanese encephalitis virus prME in Pichia pastoris and immunogenicity evaluation of the virus-like particles in mice. Chin J Biotech, 2017, 33(5): 863–874. 摘 要: 应用毕赤酵母分泌表达日本脑炎病毒 (Japanese encephalitis virus ，JEV) prME 蛋白，鉴定其表达效果 与免疫原性，以期为JEV 亚单位疫苗的研制奠定基础。RT-PCR 扩增JEV SA14-14-2 株 prME 基因，将其连接 到毕赤酵母表达载体 pPICZa-A ，分别获得 pPICZa-prME 和携带 JEV Cap 蛋白 C 末端 19 个 Aa 信号肽的 pPICZa-SprME 质粒。表达载体用 Pme Ⅰ酶切线性化，通过电转化转入毕赤酵母 X33 并诱导发酵培养。利用 SDS和Western blotting 鉴定酵母发酵上清中目的蛋白的表达情况。利用GE 蛋白层析纯化柱纯化目的蛋 白，利用电镜观察纯化前后的目的蛋白，将不同剂量纯化后的 prME 蛋白与弗氏佐剂混合以及定量纯化后的 prME 蛋白与不同剂量的核酸佐剂混合分别免疫4 周龄小鼠，定期采血，ELISA 检测被免小鼠血清的抗体水平， 空斑减少试验测定抗体中和效价。SDS结果表明毕赤酵母可以分泌表达完整的prME 蛋白，目的蛋白在 70–100 kDa 之间；Western blotting 结果显示分泌表达的prME 蛋白具有良好的反应原性，进一步证明prME 蛋 白在酵母 X33 中以整体的形式分泌表达，没有发生水解切割。纯化目的蛋白，根据洗脱时间和体积表明其分 子量大于 1×106 Da ，因此推断prME 蛋白可能形成多聚化的颗粒。电镜观察发现直径30–50 nm 的病毒样颗粒 (Virus like particles ，VLPs) 。免疫试验结果表明，纯化后的重组蛋白10–15 μg/只接种小鼠在3 周后抗体达到高 峰值，之后逐渐下降，免疫 7 周后小鼠血清仍可检测到JEV 抗体。将prME VLPs 以10 μg /只的剂量与不同剂 量的核酸佐剂配伍后接种小鼠，ELISA 检测结果表明核酸佐剂可明显增强JEV prME VLPs 免疫应答，免疫4 周后小鼠血清的中和抗体效价为 1 ∶80–1 ∶160。上述结果表明毕赤酵母表达JEV prME 虽不能发生水解切割， 但仍可形成VLP 并诱导免疫小鼠产生较高水平中和抗体。 : 日本脑炎病毒，prME 蛋白，毕赤酵母，病毒样颗粒，免疫原性 Received: January 21, 2017; Accepted: April 5, 2017 Supported by: Special Funds for Agro-scientific Research in the Public Interest (No. 201203082). Correspondin