流式细胞术在风湿免疫病中的应用_培训课件.ppt

流式细胞术 风湿免疫病 北京协和医院 风湿免疫科 赵丽丹 常用的流式细胞仪与流式分析软件 BD-FACSDiva Flow Jo CellQuest WinMdi FCS Express CFlow Sampler Analysis （ Accuri C6 Flow Cytometer） ModFit LT—增殖分析 骨髓和器官移植 基础医学 流式细胞仪的临床应用 免疫病 血液病 肿瘤性疾病 感染性疾病 外周血淋巴细胞 T淋巴细胞 NK细胞 外周血免疫细胞亚群 CD16+CD56+ T辅助细胞 CD3+ CD19+ T8细胞 B淋巴细胞 CD4+ CD8+ Na?ve T CD45RA+CD45RO- Memory T CD45RA-CD45RO+ CD95 DR CD38 活化标志 细胞毒T细胞 抑制型T细胞 CD28＋ CD28－ 增殖标志 Ki-67 DC细胞 pDC 抑制型T细胞 CD11c-CD123high CD11c+CD123low/- 免疫细胞的性质 吞噬能力、分泌细胞因子的能力 免疫调节功能 发育、分化和成熟 迁移和趋化能力 增殖与凋亡 表型和数量 流式细胞仪在 免疫病中的应用 1 2 3 4 了解体内免疫功能状态—细胞亚群分析 ? 细胞免疫：T细胞/na?ve T/活化T ? 体液免疫：B细胞 辅助疾病诊断 ? HLA-B27 ? HLA-B5 ? HLA-DR4 探索疾病的发病机理、病程、预后 ? Th17、Treg ?BR3、TACI、BCMA ? 血清中多种细胞因子 监测指导临床治疗方案 ?美罗华—B细胞 ? Belimumab —B细胞 ? 预防性抗PCP 流式细胞术在免疫学中的应用 免疫学研究中常用的流式方法 细胞表面染色 荧光选择与配伍 避免交叉污染 调节补偿 胞内分子及细胞因子染色 破膜/固定剂 同时测定多种细胞因子 PMA/Ionomycin +Golgi阻断剂 --CD4荧光的选择 细胞增殖及凋亡分析 CFSE 增殖分析 DNA分析 PI-Annexin Ⅴ Casepase 检测 细胞分选 流式细胞术对免疫细胞亚群测定的范例 Anti-CD20不同发育阶段B细胞的影响 临床应用 抗CD20单抗治疗中监测淋巴细胞亚群的临床意义 初始治疗 B细胞显著增多→应用价值； CD4+T细胞显著减少→应用风险； 治疗中的监测 B细胞清除效应→预测治疗效果（临床效果与B细胞清除相关，*长寿命浆细胞） 随访中的病情监测 B细胞恢复－病情复发－强化治疗； 感染风险评估 细胞免疫功能与机会性感染 指导临床治疗： 加强免疫抑制治疗 vs 经验性抗感染治疗 CD4/CD8 （参考值1～2） ＞2：细胞免疫功能过度活跃 1：病毒感染、恶性肿瘤 CD4 200 ：PCP、隐球菌、分支杆菌感染的风险↑ Na?ve T 、 CD28＋的CD4减少易发生机会性感染 免疫缺陷病的诊断和定位 X连锁无丙种球蛋白血症 XLA 外周血和淋巴组织中B 细胞减少或缺失，Ig缺乏 男性婴幼儿，6~9月发病，反复化脓性感染 普通变异性免疫缺陷病CVID IgG显著低下，B细胞减少或正常，na?ve T减少 青壮年，反复化脓性呼吸道感染 选择性IgA缺陷、选择性IgG亚类缺陷 高IgM综合征 X连锁重症联合免疫缺陷SCID T细胞和NK细胞减少，B细胞可正常 新生儿、婴幼儿，病毒、PCP、念珠菌、败血症 Moleculars as therapeutic target 5 6 Rituximab / ocrelizumab; 2. Anti-CD40L; 3. Atacicept / Belimumab; B cell tolerogen--Abetimus sodium; 5. Abatacept; 6. Epratuzumab; FC对于基础研究的重要性 细胞分选 细胞增殖 基因研究—GFP标签 高通量的细胞因子测定——CBA …… Science is hard. Flow cytometry should be easy. CFSE HC SLE CD4+T：CDI=0.98 CDI=1.72 CDI=5.25 CFSE细胞增殖的流式测定 CBA（Cytometric Bead Array） assay Terasawa H et al. Clin Cancer