流式细胞术在免疫学中的应用.pdf

流式细胞术在免疫学 中的应用 河北医科大学第四医院 刘亮 流式细胞术在免疫学中的应用 ) g o l ( E P 4 1 D C CD45 FITC (log) 流式细胞术简介 • 流式细胞术（Flow Cytometry. FCM） 是20世纪70 年代发展起来的一种快 速对单细胞定量分析和分选的新技 术, 能定量分析细胞的生物化学成分 及对实验者感兴趣的细胞进行分离。 一、流式细胞免疫学样品制备的基本原理 • 流式免疫技术是研究以单细胞或单细胞核为基础，并结 合传统的免疫学方法，其基本原理是细胞上的抗原(或 细胞膜受体)与相关的单克隆抗体结合，形成带有荧光 的抗原抗体复合物，通过流式细胞术测定其特定荧光量。 二、流式免疫学染色方法 流式免疫样品的染色: 1)直接免疫标记法 2)间接免疫标记法 1. 直接免疫荧光标记法： • 该方法是国内外学者利用最多的一项免疫荧光技术 。 6 • 取一定量的细胞(约1×l0 细胞/ml)直接加入与荧光素交联的抗体 进行免疫标记反应，如做双参数标记染色，可把两种标有不同荧 光素的抗体同时加入。 • 本方法的优点是所测定结果准确，操作简便，阴阳性结果易 分析，适用于同一细胞群体多种参量标记的测定。 • 但缺点是在检查每一抗原时都要制备与抗原相关的荧光标记 抗体，不但荧光抗体制备复杂，而且费用昂贵。 2. 间接免疫荧光标记法： 6 • 取一定量的细胞或细胞核悬液约 1x 10 细胞 /ml 加入特异的第一抗 体，待结合反应一定时间后，洗去多余的抗体，加入荧光标记的第 二抗体，形成一种抗原－抗体－抗抗体免疫复合物，通过FCM检测 其荧光。 • 本方法优点是操作较简单，费用较低，只要制备相关的第一抗体， 二抗可较广泛的应用。 • 缺点有：由于二抗常为多克隆抗体， 非特异性荧光背景较强， 非特异性结合较多，影响了实验结果的分析，因此，在样品 制备的同时应增设阴阳性对照，避免测定结果的假阳性，另 外，由于间接免疫荧光标记步骤较多，增加了细胞的丢失。 三、流式细胞术检测细胞免疫功能 与人体免疫功能有关的主要