流式细胞仪培训课件.ppt

流式细胞仪分选 电荷式分选是当前的主流分选模式 高速分选是保证结果的基本条件 高纯度和高活性是分选的基本要求 可选的激光要多样化（空冷、水冷、固体；不同的波长；真正的紫外） 提供多种分选流动室 光路稳定，紫外激光功率大 流式分选和磁珠分选的差别和联系 流式细胞仪 显微镜 流动的细胞 静止的细胞样本 数量大 数量少 高速分选 样本难以再利用 细胞群体特征量分布 可以揭示细胞内部结构信息 特殊的显微镜 高速测定细胞，大样本计数 检测稀有细胞 多参数分析 自动化 细胞分选 流式细胞仪的主要特点 二、流式细胞仪工作原理 流式细胞仪工作原理 流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号被光电二极管和光电倍增管接收，之后转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，最后由计算机进行计算处理。 仪器基本组成 流路 流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5?105-1?106个/ml 光路 光源 滤片 光电倍增管PMT HV 电路 放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换 统计 计算机 流路 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 流动室 流式细胞仪光路图 Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quartz Flow Cell Forward Scatter Detector Side Scatter Detector 525BP FL1 (FITC) 575BP FL2 (PE) 620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5) 488DL 488BK 550DL 600DL 645DL 流动室 激光配置 488nm氩离子激光器 633nm氦氖激光器 大功率水冷紫外激光器 光路 - 滤片特性 长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 – 允许一定带宽的波长通过 当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 ，这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter) 630 nm BandPass Filter White Light Source 光信号收集 光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。 二色镜 1 2 3 带通滤波片 光电倍增管 激光束 细胞 收集透镜 前向散射光 侧向散射光，荧光 数据处理 FSC SSC FL1 FL2 FL3 对数 线性 线性 线性 对数 脉冲处理，模数转换 光信号 电信号 记录数据，显示结果 （面积，峰高，宽度） 颗粒度 细胞大小 流式细胞仪产生的信号 非荧光信号 FL1 – FITC,GFP…(PMT2) FL2 – PE (PMT3) FL3 – ECD,PI… (PMT4) FL4 – PC5,APC… (PMT5) 荧光信号 细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合物。 通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。 原理 488nm空冷激光 ： FITC、PE、ECD、PC5、PI、7AAD、 PerCP 、EGFP 、EYFP 、AO 、TO 、Fluo3 633nm空冷激光： APC、APC-CY7 、CY5 90-4水冷激光：UV（333-364nm） HOECHST 33342、DAPI … 三、流式细胞仪应用 流式细胞仪应用 淋巴细胞免疫功能测定 干细胞研究 细胞增殖与凋亡检测 细胞周期及倍体分析 细胞活性分析 细胞分选 …… 淋巴细胞亚群 活化的T淋巴细胞 抗原特异性免疫细胞 调控性T细胞 树突状细胞 先天免疫细胞 细胞免疫功能测定 细胞群 CD抗原 T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 NK细胞 CD1