利用MigR1质粒构建CD19-CAR逆转录病毒载体优化其对人原代T细胞的转染效率.pdf

空堡血邃堂苤盍2Q15生垒旦箜3§鲞筮垒期丛i!』丛!坐B!!!：△画12Q!§：yQ!：3§：盟!：垒 33l· ·论著· 19．CAR逆转录 利用MigRl质粒构建CD 病毒载体优化其对人原代T细胞的 转染效率 王扬詹古生徐丽丽 阮婕程辉周虹华亦斐 胡晓霞顾海慧钱宝华王健民杨建民 【摘要】 目的优化二代CDl9嵌合抗原受体(CDl9一cAR)逆转录病毒载体对人原代T细胞的转 染效率。方法应用重组DNA技术将CDl9．CAR构建入逆转录病毒载体，转，A．plat．A包装细胞收集 病毒上清并转染人原代T细胞及K562细胞系，采用流式细胞术检测不同条件下的转染效率，用 RT-PCR方法检测目的基因的表达情况，用ELISA法检测IFN．Y、TNF．c【表达水平。结果①MigRl一 CDl9一CAR逆转录病毒载体成功构建后包装高滴度逆转率病毒；②相同条件下，MigRl．CDl9-CAR逆 转录病毒对K562细胞系转染效率显著高于T细胞；③对T细胞，离心120min组的转染率为(54．5士 14．6)％，明显高于未离心组、离心30min组及离心60min组(P值均0．05)；@CD3／CD28磁珠与rhIL．2 联合对人T细胞活化扩增效率个体差异显著，根据扩增倍数优化个体转染时机可提高转染效率(最高 h 达69。3％)，且RT-PCR检测证实CDl9-CAR目的基因在转染后72T细胞中高效特异性转录； 230+ ⑤CDl9．CAR．T细胞与CDl9．K562细胞共培养组IFN．Y、TNF．a表达水平均增加，分别为(13 1 543)pg／ml、(4217士211)pg／ml，与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P值均O，01)。结论通过 MigRl．CDl9一CAR逆转录病毒载体转染人原代T细胞，并通过延长离心转染时间、根据扩增倍数确定 个体转染时机而成功优化转染效率，RT-PCR检测CDl9，CAR目的基因在转染后人T细胞中高效特异 性转录，CDl9．CAR—T细胞特异性识别靶细胞引发IFN．1，、TNF．c【表达水平增加。 【关键词】受体，抗原；质粒，MigRl；转染；T淋巴细胞；细胞因子类 of retroviralvectorandmodificationofitstransductionofhuman ConstructionCDl9-CAR Li珏．Ruan Hui,Zhou H缸穆g Hong,HuaYife￡H拄 1-iymphocytes7勋挂g．‰gGusheng,xMJie,Cheng Xiaoxia，Gu Haihui，QianBaohua，WangJianmin，YangJianmin’．*DepartmentofHematology,Changhai Medical Hospital,SecondMmtary University,Shanghai200433,China Correspondingauthor．YangJianmin，Email：yang]ianmin@CSCO．org．cn To the 【Abstract】0bjective improveMigRl一CDl9一CAR(chimericantigenreceptor)that a variable toCDl9 a retroviralvector contains chain single region(scF