青霉素培养基优化.ppt

青霉素生产的培养基优化的具体实验方法 培养基优化的基本原理 一个批发酵(流加发酵):可以分为生长期和产物形成期两个阶段。 第一阶段:控制菌体的生长,目的是使长好的菌体能够处于最佳的产物合成状态,即如何控制有利于微生物催化产物合成所需酶系的形成.。 第二阶段:控制产物的合成;找出影响反应速度变化的主要因素并加以控制使产物的形成速度处于最佳或底物的消耗最经济。 生产青霉素的菌种 目前，国内青霉素生产菌按其在深层培养中菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种。 根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和绿孢子丝状菌，常用菌种为绿孢子丝状菌，如产黄青霉菌。 青霉素制备的一般流程图 菌种 孢子制备 种子制备 发酵 发酵液预处理及种子加滤 提取及精制 成品检验 成品包装 前体物质 前体：某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入而有较大的提高。 青霉素产生菌的生长过程 分生孢子发芽期 菌丝繁殖期 脂肪粒形成期 脂肪粒减少，小空孢 大空孢 自溶 青霉素发酵培养基成分： 碳源：青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖 等。目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。 氮源：可采用玉米浆（0.3%-0.4%）、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉等有机氮源，及醋酸铵（提供氮源，同时提供碳源）、氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等无机氮源。 前体：为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需要在发酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它们对青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次流加方式加入。 无机盐：包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子对青霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在30ug/mL以下。 青霉素发酵培养基基本配方 乳糖----------22.5g, 葡萄糖----------7.5g, 醋酸铵----------8.0g, Na2SO-----------40.5g, MgSO4?7H2O----------0.25g, FeSO4?7H2O----------0.1g, CuSO4?5H2O----------0.005g, MnSO4?7H2O----------0.02g, CaCl2?2H2O----------0.05g, ZnSO4?7H2O----------0.02g, 苯乙酸---------1.0g, 蒸馏水---------1000ml, pH 6.5 121℃灭菌20min 碳源PK：乳糖比葡萄糖更优越 青霉素的生物合成，受糖分解代谢产物的阻遏，如合成青霉素的酰基转移酶就会被阻遏。 在青霉素发酵过程中，被青霉素迅速利用的葡萄糖有利于菌体生长，但抑制青霉素的合成。 被缓慢利用的乳糖，水解成单糖的速度正好符合青霉素生产期合成青霉素的需要，而又不会产生高浓度的分解产物来抑制青霉素的合成，是生产青霉素的优越碳源。 但是，由于乳糖价格较贵，成本较高，故在生产实践中常通过间隙或滴加葡萄糖的方法控制培养液中糖的含量，以符合菌体生长和青霉素生物合成的需要。 这样，在青霉素的生产中，降低了生产成本的同时，又提高了青霉素的产量。 青霉素培养室 培养基优化步骤： 1、发酵培养基的配制:按照正交表配制50ml。(三组:每组配制一种培养基,各接种一瓶,250ml 三角瓶装液量为50ml) 2、摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基, 25℃200rpm 培养6-7 天,可进行青霉素的效价测定。 3、金黄色葡萄球菌菌悬液的制备:将37℃培养16-18h 的斜面菌种,用0.9%生理盐水洗下，菌悬液稀释至波长650nm 透光率为20%的溶液,需要12ml。 4、生测平板的制备:生测培养基400ml,加入适当稀释的金黄色葡萄球菌后,制成3*6+2 个平板。 5、青霉素发酵液效价的测定: 发酵结束后5000rpm 离心5min．每个被测样品用3 套平皿进行测定；37℃培养18-24h 后,量取抑菌圈直径的大小。 6、填正交实验表格,确定最优培养基配方。 正交实验表特点 （1）任何两因素之间的都是全面实验，从而保持了可比性。即任何两个因素的各种不同水平的搭配在实验中都出现了，并且出现了相同的次数。 （2）任一因素个水平的重复次数相等。 （3）绝大多数正交表中各列是等价的，可以任意取用。因此，正交表的实验结果非常易于分析，以至于不需要进行复杂的统计计算，就可直接求出各因素影响的大小、效应的变化趋势等。 针对三因子进行正交实验 乳糖----------22.5g 或葡萄糖----------