第3章 细胞融合与单克隆抗体-2课件.ppt

3.2.3单克隆抗体的规模化生产 杂交瘤细胞直接植入动物体内： 1.将106-107的单克隆杂交瘤细胞，由皮下植入同系或组织相容正常的小鼠的体内，约过两周后，在小鼠的皮下形成相应的移植性肿瘤，用这些肿瘤再去接种更多的小鼠。 2.在肿瘤出现后的一段时期，通过多次采血得到含单克隆抗体的血清，每ml血清内约含1-10ml的抗体，但取血量有限。 3.因此，可将相同数量的单克隆抗体细胞植入在3-10天前经腹腔注射0.5ml异十八烷或其它矿物油的初次致敏的小鼠腹腔内。在接种后的二周左右的时间内，经穿刺而得到5-10ml的腹水，内含单克隆抗体的浓度5-20mg/ml 3.2 单克隆抗体技术 现在的生物技术公司一般采用生物反应器悬浮培养的方法生产单克隆抗体。由于杂交瘤细胞的高密度生长，使得抗体效价可达到10~100mg/ml。 美国Damon公司的专利方法是将细胞培养在一种中空的微球体内，这种被称之为微囊的微球体外面由多孔膜包裹，使内部生长的杂交瘤细胞受到多层保护而不受环境影响。此种微囊技术生产的抗体可达0.1-1g/L。抗体的生产达到一定的规模。 3.2 单克隆抗体技术 影响因素分析 （一）污染 （二）融合后杂交瘤不生长 PEG有毒性或作用时间过长 牛血清的质量差，用前未严格筛选 骨髓瘤细胞污染了支原体 HAT有问题（A过高或HT含量不足） 3.2 单克隆抗体技术 （三）杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体 HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A 抵抗细胞所致 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好 细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆 竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的 生长；也可能发生染色体丢失。 3.2 单克隆抗体技术 抗体 (Ig) : （Immunoglobulin) 抗体分类： IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE 抗体结构 3.2 单克隆抗体技术 抗体作用的机理 中和反应 聚集反应 沉淀反应 补体活化 3.2 单克隆抗体技术 每个B淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特异性抗原决定簇的抗体，而由这一个细胞通过有丝分裂繁殖形成的细胞群称为“克隆”，由这一个克隆系产生的抗体称为单克隆抗体 3.2 单克隆抗体技术 3.2.1单克隆抗体技术的基本理论 正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是Kohler和Milstein 于1975年将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。 3.2 单克隆抗体技术 Georges J. F. Kohler César Milstein 3.2 单克隆抗体技术 单克隆抗体 (monoclonal antibody) 随着在研究上应用日益广泛，对抗体的数量和质量 （专一性）要求越来越高 数量多: 传统的实验动物马,兔等免疫不方便 质量高: 大动物免疫难以做到单克隆 3.2 单克隆抗体技术 3.2 单克隆抗体技术 单克隆抗体生产技术 (杂交瘤技术) 用细胞融合技术获得单克隆抗体综合了两方面优势： 淋巴细胞肿瘤: 能不断增殖，没有产生专一抗体能力。 从脾脏得到淋巴细胞: 能产生专一抗体，不能不断增殖。 3.2 单克隆抗体技术 3.2.1.1杂交瘤技术的基本原理 利用细胞融合技术，将已免疫过的B细胞与骨髓瘤细胞融合，在由此形成的单个杂种细胞中，B细胞提供产生单一型抗体的遗传信息，瘤细胞提供连续增殖的遗传信息。 因此这种杂种细胞既能产生抗体又能无限繁殖。 3.2 单克隆抗体技术 高度均一性： 纯度很高的均一性抗体 高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应 大量产生及稳定性： 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖之传代 3.2.1.2 单克隆抗体的特性 3.2 单克隆抗体技术 3.2.1.3 亲本细胞的选择 骨髓瘤细胞： 1.本身不能分泌抗体 2.选择次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT-）或者胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）的骨髓瘤细胞 3.2 单克隆抗体技术 B淋巴细胞： 1.经特定抗原免疫能产生目的抗体的动物淋巴细胞 2.免疫动物种系要与骨髓瘤细胞系一致或有相近亲源关系 3.2 单克隆抗体技术 3.2.1.4 融合细胞的选择原理 1964年Litterlefield—— HAT培养基 H—Hypoanthine