3细胞融合及单克隆抗体的制备.ppt

细胞融合单克隆抗体制备技术 1.细胞融合（Cell Fusion） 细胞融合：即两个或两个以上细胞合并成一 个细胞的过程，即将两个离体细胞在特殊融 合剂的作用下，细胞膜发生一定变化，使两 个或多个细胞发生融合，形成体细胞杂交 (Somatic Hybridization)，产生一个新的杂 种细胞(Hybrid) 。 细胞融合剂 病毒类 化合物 生物制剂 2.单克隆抗体技术 Epitope, Antigenic determinant抗原决定簇 一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇 每个抗原决定簇至少诱生一种专一性抗体 蛋白质性抗原决定簇含有六个以上氨基酸 多克隆抗体(Polyclonal antibody,PcAb)： 针对多种抗原决定簇的混合抗体 单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb): 由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原 决定簇的同源抗体 单克隆抗体技术操作流程 常规免疫法 改进后的方法： 在适当稀释的杂交瘤阳性克隆上清中加上过量 抗原，再用上述致敏的红细胞（指示细胞）进 行检测，则为血凝抑制。改进后的血凝抑制试 验是种检测抗体特异性的简单有效的方法。 原理：当鼠McAb与靶细胞表面抗原结合 形成膜Ag-Ab复合物后，加入适量补体， 在补体介导下，使细胞破坏（打孔），以 致细胞破裂死亡。 单抗纯化方法 盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析法 辛酸沉淀法 用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。 大量的盐加入到蛋白溶液中，高浓度的盐离子有很强的 水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水发 生凝聚而沉淀析出。 血清 50%饱和度硫酸铵 上清 （白蛋白） 沉淀（球蛋白） 33%饱和度硫酸胺 上清 沉淀 拟球蛋白 r球蛋白 凝胶过滤 干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将 蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分 子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内，留在 胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最先流出，小 分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到 凝胶的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢， 据此将不同大小的蛋白质分离出来。 交联葡聚糖凝胶(Sephadex) 琼脂糖凝胶(Sepharose) 离子交换层析法 DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称阴离子交换剂 CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳离子交换剂 亲和层析法 将抗原连接到 固相载体上， 特异性吸附液 相中的抗体， 形成抗原抗体 复合物，然后 改变条件，使 抗原抗体复合 物解离洗脱出 纯化的抗体。 举例 抗HLA-G单克隆抗体的研制 及其初步鉴定 技术路线 方法与结果 美联（西安）生命科技有限公司合成24肽 ： EEETRNTKAHAQTD RMNLQTLRGC-COOH（MW：2802） α1区第61～83（85-107）位氨基酸 羧基端接一个Cys构成的24肽 纯度要求95%以上 遗传学特性的分析 HLA-G特异性鉴定 间接免疫荧光 FCM 腹水滴度分析 稳定性观察 染色体数众数：93 （四）融合 效价最高的小鼠冲击免疫3天后取脾细胞 取预先准备好的SP2/0细胞 产生的实体瘤、分离细胞 SP2/0 免疫小鼠脾细胞 PEG诱导的细胞融合 接种于HAT选择培养液 饲养细胞 HAT培养基筛选 H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶 DNA 谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸 二氢叶酸还原酶 A H T 外源性途径(旁路途径) (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT ) 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase) B淋巴细胞： HGPRT+