高效液相色谱法大学.ppt

第2章 高效液相色谱法;第1节 概述 第2节 HPLC的分类与基本原理 第3节 各类高效液相色谱法 第4节 固定相 第5节 流动相 第6节 高效液相色谱仪 第7节 定性、定量分析方法 第8节 应用与示例;第1节 概述; 色谱法（Chromatography）是一种分离分析方法，是目前科研和生产分析中广泛采用的一种重要工具。一句话，色谱法非常有用，必须掌握。 一、色谱法简介 色谱法是1901年由俄国植物学家茨维特（Tswett)）提出，最初的认识是在于它的分离价值，用于分离植物中的色素等有色物质。现代的色谱方法，不再???限于有色物质，也大量用于分离无色物质。;俄国植物学家茨维特使用的装置： 色谱原型装置如图，用来分离植物叶片的色素。管子中的填充物固定不动，称为固定相（碳酸钙）；将色素提取物置于管子上端，靠重力往下流，同时用石油醚淋洗；石油醚称为流动相（携带试样混合物流过固定相）。 管子及填充物可以称为色谱柱。 色谱三元素！;概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60年代末，以经典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高效固定相、高压输液系统和高灵敏度的在线检测器，从而发展起来的一种新型分离分析技术。随着科学和技术的不断改进与发展，目前已成为应用极为重要、广泛的分离分析手段. 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。;一、基本概念与特点; 保留体积（VR）： VR = tR×qv qv为柱出口处的载气流量， 单位：m L / min。 死体积（VM）： VM = tM ×qv 调整保留体积(VR＇)： V R＇ = VR －VM ;3. 相对保留值r21;4.区域宽度;分配系数（ partition coefficient） K;分配系数 K 的讨论：;3.分配比 （partition radio）k; 塔板理论的假设： (1) 每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到； (2) 将载气看作成脉动（间歇）过程； (3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略； (4) 每次分配的分配系数相同。; 色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为;;塔板理论的特点和不足;色谱理论：速率理论-影响柱效的因素;载气流速与柱效——最佳流速;速率理论的要点：;分离度;讨论：;分离度的表达式：;讨论：;二、HLPC与经典液相色谱和气相的比较;二、HLPC与经典液相色谱和气相的比较;图10－1 HPLC仪器结构图;第2节 HPLC的分类与基本原理; 1. Van Deemter方程式;HPLC的分离条件： ① 采用粒径小而均匀的球形固定相，首选化学键合相，用匀浆法装柱。 ② 采用低黏度流动相，低流量(1mL/min)，首选甲醇。 ③ 采用柱温箱，避免室温波动，增加实验重复性，柱温以25～30℃为宜。;按固定 相分类;详细分类图;三、各类高效液相色谱法;1. 吸附色谱法 LSC;1. 吸附色谱法 LSC;2. 分配色谱法(LLC);3. 化学键合色谱法;⑴反相键合相色谱法，RBPC ⑵正相键合色谱法， NBPC ⑶离子对色谱法，IPC or. PIC ⑷离子抑制色谱法，ISC ⑸其他色谱法;⑴反相键合相色谱法 RBPC 典型的反相键合色谱法(RBPC)，是用非极性的键合固定相和极性流动相组成的色谱体系。 固定相常用十八烷基硅烷键合相(ODS或C18)； 流动相常用甲醇－水、乙腈－水。 非典型反相键合色谱系统，用弱极性或中等极性键合相与极性大于固定相的流动相组成。; 分离机理：反相键合相表面具有非 极性烷基官能团和未被取代的硅醇 级，分离机理较复杂，有疏溶剂理论、 双保留机理、顶替吸附－液相相互作 用模型等。 疏溶剂理论：把非极性的烷基 键合相看作一层键合在硅胶表面上的 十八烷基的“分子毛”，它有较强的疏 水特性。如图10-4所示。; 当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官 能团的有机化合物时，一方面分子中的非极性 部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作 用，使它保留在固定相中；另方面被分离物的 极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开 固定相，并减小其保留作用。结果两种作用力 之差，决定了分子在色谱中的保留行为。; ;正相键合色谱法(NBPC)： 固定相一般以氰基或氨基等极性基团作为键 合相；流动相以烷烃(正己烷)中加入适量的极 性调整剂(如氯仿、甲醇、乙腈等)为流动相。 用途：主要用于分离极性不同的化合物、异 构体，特别适用于分离不同