高效液相色谱法.ppt

*高效液相色譜法*高壓輸送流動相高效固定相高靈敏度檢測器現代液相色譜分析方法——分離分析*HPLC與經典液相色譜法比顆粒極細、柱效高，分離效率高高壓輸液泵輸送流動相高靈敏度檢測器（紫外，螢光）HPLC與氣相色譜法比不受試樣的揮發性和熱穩定性限制可用各種溶劑作流動相在室溫下分離*第一節高效液相色譜法的主要類型和原理一、高效液相色譜法的主要類型 按照分離機理分類：分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法空間排阻色譜法………正相反相離子抑制離子對**二、化學鍵合相色譜法以化學鍵合相為固定相的色譜法，簡稱鍵合相色譜法正相（鍵合相）色譜法：固定相極性大於流動相極性的液液分配色譜法--反相（鍵合相）色譜法：*（一）正相（鍵合相）色譜法1.固定相：極性鍵合相如氰基(－CN)、氨基(－NH2)鍵合矽膠2.流動相：烷烴加醇類3適用範圍：極性至中等極性的分子型化合物*4.保留行為：組分極性↑，k↑，tR大，後洗脫出柱。流動相的極性↑，洗脫能力↑，組分k↓，tR↓，先洗脫出柱。分離機制：分配或吸附*（二）反相鍵合相色譜法1.固定相：非極性鍵合相如十八烷基矽烷（C18，ODS）/辛烷基(C8)鍵合矽膠2.流動相：水為基礎溶劑，加入一定量與水混溶的極性調整劑常用甲醇－水、乙腈－水等3.應用：非極性至中等極性的組分，還有有機酸、堿及鹽等*4.分離機制——疏溶劑理論溶質的保留主要是非極性溶質分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質分子與鍵合相的烴基發生疏水締合。*（1）溶質的分子結構（極性）極性↓，疏水性↑，k↑，tR↑ 同系物碳數越多，極性越弱，k越大 引入極性取代基，降低疏水性，k值變小（2）固定相鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長↑，溶質的k↑矽膠表面鍵合烷基的濃度↑，溶質的k↑5.保留行為主要影響因素*（3）流動相極性↑，洗脫能力↓，使溶質的k↑溶劑比例：水的比例↑，使k↑pH：影響弱酸、弱減的離解 流動相的pH降低，弱酸k↑，tR↑；弱鹼k↓*——用少量弱酸、弱鹼或緩衝溶液，調節流動相的pH，抑制有機弱酸、弱鹼的離解，增加疏水締合作用，使k變大。適用於3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱鹼如離子抑制色譜法*（一）鍵合相的種類1.非極性鍵合相：非極性烴基，如C18﹑C8﹑C1與苯基等用於反相色譜；長鏈烷基可使溶質的k增大，選擇性改善，載樣量提高，穩定性更好。一、化學鍵合相色譜法的固定相第二節高效液相色譜法固定相和流動相及其選擇*2.弱極性鍵合相：醚基和二羥基等鍵合相用於反相或正相色譜3.極性鍵合相：常用氨基﹑氰基鍵合相（≡Si(CH2)3NH2,≡Si(CH2)2CN)鍵合矽膠一般用於正相色譜*（二）鍵合相的性質和特點1.鍵合反應矽氧烷（Si－O－Si－C）型：如：YWG－C18H37，無定形矽膠YWG上鍵合了十八矽烷基；SpherisorbODS，球形矽膠Spherisorb上鍵合了ODS。*含碳量：含碳的百分數，表示鍵合反應的量覆蓋度：已反應的矽醇基數目占矽膠表面矽醇基總數的比例封尾：在鍵合反應後，用三甲基氯矽烷等進行鈍化處理，減少殘餘矽醇基。2.鍵合相的性質注意：流動相的pH一般應在2-8（矽膠溶解）。*二、化學鍵合相色譜法的流動相對試樣有適宜的溶解度，k在1~10範圍內，最佳範圍2~5；與檢測器相適應。例如用紫外檢測器時，選用截止波長小於檢測波長的溶劑。純度高，粘度小。（低粘度流動相如甲醇乙腈等可以降低柱壓，提高柱效）對流動相的要求：*流動相對分離的影響n由色譜柱（固定相）性能決定；α主要受溶劑種類的影響；k受溶劑配比的影響。*三、分離條件的選擇

（一）HPLC中的速率理論1.渦流擴散項A=2λdp球形、小粒度、均勻固定相，勻漿高壓填充，降低A2.縱向擴散項B=2γDmDm很小，且UU最佳，忽略H=A+Cu*3.傳質阻抗項(1)固定相傳質阻抗係數CS忽略，因df小(2)流動相傳質阻抗係數C=Cm+Csm**動態流動相傳質阻抗-在流路中心組分走的快

*靜態流動相傳質阻抗-部分組分分子在固定相微孔內滯留

C∝dp2/DmDm∝T/?要求:固