聚合酶链反应及其应用.ppt

/primers/javascript/长度、最大Tm值、最小Tm值、误配碱基对数等四种参数输入引物序列其特殊的优点是能限定所输入的序列中适合引物设计的区域，这对检索若干kb长的DNA片段中各种可能的引物是很有利的。而且能根据三种计算方法显示正反向引物的Tm值，可以随意更换碱基以提高或降低Tm值同时还能提供引物稳定性的参数，包括发夹结构、引物二聚体、引物相似性等。缺点是不能计算发夹结构、引物二聚体的响应Tm值。引物的在线设计工具及免费软件简介Primers!是一种基于Java的引物设计程序，可以选择所期望的引物Primers!引物的在线设计工具及免费软件简介其它的在线设计网站WWWGeneFisherhttp://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher//webprimers.htmlWebPrimers1NetPrimereractiva.de//netprimer.htmlhttp://www.path.cam.ac.uk/cgi-bin/primer3.cgi2ProjectDOPE2Oligos-U-LikePrimers3PCR引物的使用PCR引物的标准使用范围：0.1-1.0mM，最好0.2-0.5mM添加标题特异性的改进：降低引物和dNTP的浓度可以在很大程度上改添加标题有效性的改进：增加引物与模板的分子比；如果引物中有不配添加标题善PCR扩增反应的特异性，高浓度的引物往往会导致非特异性添加标题的退火及副产物形成，同时也会促进引物二聚体的产生。在模添加标题板量一定的情况下，降低引物浓度实际上也是降低引物与模板添加标题的分子之比。添加标题对的碱基，则适当降低引物的浓度。添加标题5PCR反应的其它控制参数脱氧三磷酸核苷酸（dNTPs）添加标题预热变性温度和时间添加标题Mg+2离子添加标题退火杂交温度和时间添加标题延伸聚合温度和时间添加标题循环次数添加标题反应体积添加标题脱氧三磷酸核苷酸（dNTPs）dNTPs的标准使用范围：20-200mM1特异性的改进：降低dNTPs的浓度，但要注意Mg+2的摩尔浓度2有效性的改进：对于较大分子量的模板，应适当提高dNTPs的量3如果一种dNTP的浓度过高，它就会优先掺入到延长链中，造成4扩增产物的不准确，因此要保持四种dNTPs的一致。此外，保5持四种dNTPs的浓度略高于DNA聚合酶对各种dNTPs的Km值也6很重要（10-15mM）。7也应同步降低。8准确性的改进：降低dNTPs的浓度，但要注意Mg+2的摩尔浓度9也应同步降低。10Mg+2离子Mg+2的标准使用范围：0.5-10mM1特异性的改进：降低Mg+2浓度，但要注意过低的Mg+2浓度又会影2有效性的改进：提高Mg+2浓度，但过量Mg+2将导致非特异性扩增3游离的Mg+2离子浓度应高于dNTPs总浓度mM。由于Mg+24能与dNTPs形成可溶性的复合物，过低浓度的Mg+2离子将会影响5dNTPs的有效浓度。Mg+2的浓度影响扩增产物的特异性、引物退6火、引物二聚体的形成、熔点温度、酶的活性和准确性。因此，7PCR反应系统的主要优化参数是Mg+2的浓度，尤其当扩增产物大8大于1kb时，这个因素显得更为重要。9响扩增产物的产量。10A预热变性温度和时间B预热温度和时间的标准使用范围：92-96℃30secs-10minsC在酶不存在时，预热能灭活样品中有害的蛋白酶和核酸酶，同时D又能保证模板的完全变性，尤其是基因组DNA直接作为模板使用E时，更显得重要。F变性温度和时间的标准使用范围：92-96℃30-120secs退火杂交温度和时间010203040506退火温度和时间的标准使用范围：37-65℃10-120secs单击此处添加小标题特异性的改进：提高退火温度（比建议退火温度提高2-5℃）；单击此处添加小标题退火时，引物迅速杂交。不同DNA聚合酶所拥有的Tm值的差异单击此处添加小标题减少退火时间。过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量，单击此处添加小标题会改变有效的引物退火温度。单击此处添加小标题只会增加非特异性引物杂交的可能性。单击此处添加小标题延伸聚合温度和时间延伸聚合温度和时间的标准使用范围：72℃60-120secs1PCR扩增反应中普遍使用的DNA聚合酶的聚合速度每秒至少5