聚合酶链反应解析.ppt

RT-PCR及定量RT-PCR （1）RT-PCR（reverse transcription-PCR） 原理：先在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合成互补的cDNA（complementary DNA），再以cDNA为模板进行PCR反应。 是一种快速、简便、敏感性极高的检测mRNA表达的方法。 PCR技术的主要类型 常用的两种逆转录酶 AMV（avian myeloblastosis virus）： AMV来自禽成纤维病毒逆转录酶，最适温度为42℃。引物延伸反应通常用AMV性能更好，对次级结构耐受。用AMV的延伸温度可达55 ℃, 以消除次级结构，但在这样温度下，引物延伸反应的得率通常降低。 MMLV（Moloney murine leukemia virus）： M-MLV来自鼠白血病逆转录酶，M-MLV的最适温度为37℃，在更高温度下，M-MLV不稳定，但MMLV可合成更长的产物，这一特点对引物延伸反应不适用，因引物延伸反应所得的产物一般较短，为100-500个核苷酸。  （2）定量RT-PCR（qRT-PCR）： 利用RT-PCR对mRNA水平进行半定量或绝对定量分析。 半定量RT-PCR 选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的管家基因mRNA作为内源性基因模板标准。 管家基因mRNA和目的mRNA混合物共同进行逆转录，在各自的引物引导下扩增。 计算出扩增后目的基因扩增子/管家基因扩增子的比值，从而达到半定量的目的。 实时荧光定量PCR 常规定量PCR技术： —对PCR扩增反应的终产物进行定量 —重复性差 —半定量 实时定量PCR技术： 对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量 实时荧光定量PCR原理 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 SYBR Green I TaqMan探针 1.每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去。 2.染料一结合，就产生荧光信号。 3.信号强度与DNA分子总数目成正比。 （1）Ct 值 是荧光定量PCR的一个重要的概念，C代表Cycle，t代表threshold。 含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 （2）荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 Ct值的确定 （3）Ct值与起始模板的关系 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。 在阈值线设定以后，它是一个常数，我们设为M。 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值，就可计算出样品中所含的模板量。 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 Sample 25 Primer Length 48=65536bp 417p ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 — G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 — ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不应超过3 个连续的G或C，因为这样会使引物在G+C富集区 引发错误延伸 ④避免引物内部出现二级结构和引物间互补 —特别避免 3 ′端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带 ⑤引物 3′端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰） — 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致PCR失败