定量聚合酶链反应测定技术1.ppt

定量聚合酶链反应测定技术及临床应用;定量PCR测定技术之　PCR概论;PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，PCR由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成 ;定量PCR测定技术之　PCR概论;No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824;PCR的反应动力学： DNA扩增呈 指数上升，;PCR扩增的理论模式 每一扩增周期后产物的量可以下式表达： Yn=Yn-1·(1+E) 0＜E＜1 （1） 扩增产物的总数量可以下式表示： Yn=X·(1+E)n （2） ;PCR扩增的实际情况：;影响扩增效率E的因素 ——定量PCR的困难;因此在扩增产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增产物很难对原始模板进行准确定量。 ;定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别;定量PCR测定技术方法;定量PCR测定技术方法;定量PCR测定技术外标方法;定量PCR测定技术外标方法;定量PCR测定技术外标方法;定量PCR测定技术外标方法;定量PCR测定技术实时荧光定量PCR;定量PCR测定技术实时荧光定量PCR;定量PCR测定技术实时荧光定量PCR;定量PCR测定技术实时荧光定量PCR;定量PCR测定技术实时荧光定量PCR;定量PCR测定技术实时荧光定量PCR;定量PCR测定技术实时荧光定量PCR;定量PCR测定技术动力学方法;如果取的样本不连续，则可使用下述将公式（2）重排后得到的更为通用的公式，用参数j（取样中间隔的周期数）替代n，Yj（在较高循环周期数取样的产物量）替代Yn，Yi-j（在较低循环周期数取样的产物量）替代X： E＝－1＋（Yi/Yi-j）1/j (3) ;定量PCR测定技术动力学方法;定量PCR测定技术动力学方法;定量PCR测定技术动力学方法;优点: 1）不需要外标准； 2）如果能测定PCR产物分子的绝对数量，则可得到待测样本的不同的扩增效率（Ee）;定量PCR测定技术动力学方法;定量PCR测定技术内标定量方法;定量PCR测定技术内标定量方法;定量PCR测定技术内标定量方法;定量PCR测定技术内标定量方法;定量PCR测定技术内标定量方法;定量PCR测定技术内标定量方法;定量PCR测定技术临床应用;6、传染病的发病监控、预测与预防 7 、mRNA 的表达水平与是否肿瘤及其进展???关系 肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因 肿瘤标志物如癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等 8、等位基因与遗传病之间的关系 等位基因检测 多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所致遗传病检测;应注意的问题： 为什么要做定量测定？ 定性和定量测定结果报告上的混淆;定量PCR测定技术临床应用;定量PCR测定技术临床应用;1.定量测定重在定量，即如何改善扩增指数期的线性及其范围。 2.定量测定的准确性较之测定下限要重要得多。 3.非竞争性内标和竞争性内标对于使用内标的定量测定方法极为关键。合适的非竞争性内标应为在整个细胞周期中均匀表达的基因核酸，而竞争性内标则应尽可能近似原始待测模板。 4.定量测定应在扩增的指数期进行，因此，更重要的是要使涉及整个扩增过程的每个参数都理想化，以便控制整个扩增，避开扩增“平台期” 。 ;谢谢大家!